Defining determinants of asymmetric cell division: the role of nuclear lamina

The asymmetric cell division constitutes a fundamental biological process through which pluripotentstem cells or progenitor cells can both divide (through mitosis) to produce more stem cells anddifferentiate into all the specialized cells - ectoderm, endoderm and mesoderm. This kind of divisionhas been thoroughly investigated in evolutionarily simple organisms. However, some critical queriesconcerning the higher species remain unanswered.This thesis refers to such a query focusing on possible asymmetries in the nuclear lamina, adense fibrillar network on the surface of the nucleus that affects the architecture of the organelle and seems to participate in the control of gene expression in all metazoans. In the experiments weconducted we used E14 mouse embryonic stem cells. Embryonic stem cells possess the ability of selfrenewing indefinitely in the undifferentiated state and differentiate into any cell type. Our goal was to monitor asymmetric cell divisions in this cellular system and determine any quantitative or qualitative differences of A- and B-type lamins. Cells were studied not only in an undifferentiated state but also in a differentiated one. Classic markers of the asymmetric cell division and other cellular elements, such as lamins, were scrutinized during the differentiation procedure, focusing on their symmetric or asymmetric distribution. We carried out both random and directed differentiation experiments in two (2) and three (3) dimensions.Exhausting analysis showed that E14 cells always divide by symmetric dvisions. Therefore, wewanted to examine whether there are any structural asymmetries that affect the micro-architecture of the nuclear lamina or modify its dynamic behavior during mitosis. In order to thoroughly study the dynamic of both A- and B-type lamins, we constructed two cell lines that overexpress these proteins and used them in FRAP experiments. Having as our main aim the monitoring of an asymmetry between two daughter cells, we had to examine actual daughter cells in the stage of early G1 of the cell cycle, during which the nuclear envelope and, therefore, the nuclear lamina, is reorganized. Laminoverexpressing cells were transfected with the H2B m-cherry plasmid, to ensure that the cells analysed were genuine daughter. These experiments are in progress.Η ασύµµετρη κυτταρική διαίρεση αποτελεί µια θεµελιώδη βιολογική διαδικασία µέσω τηςοποίας βλαστικά ή πολυδύναµα προγονικά κύτταρα αναπαράγουν τον εαυτό τους, δίνονταςταυτόχρονα απογόνους που µπορούν να διαφοροποιηθούν προς διάφορες ιστικές κατευθύνσεις. Τοφαινόµενο έχει µελετηθεί επισταµένα σε εξελικτικώς κατώτερους οργανισµούς, αλλά ορισµένα κρίσιµαερωτήµατα παραµένουν αναπάντητα σε ό,τι αφορά τα ανώτερα είδη.Η παρούσα διδακτορική διατριβή αφορά ένα τέτοιο ερώτηµα και εστιάζεται στη διερεύνησητυχόν ασυµµετριών στην πυρηνική λάµινα, µια ινιδιακής φύσεως δοµή που επηρεάζει την αρχιτεκτονική του πυρήνα και φαίνεται να συµµετέχει στη γονιδιακή αποσιώπηση σε όλα τα µετάζωα. Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιήθηκαν τα εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα Ε14 από ποντίκια. Τα εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα (ΕΒΚ, embryonic stem cells, ESCs) έχουν την ιδιότητα της απεριόριστης αυτοανανέωσης και της διαφοροποίησης προς όλες τις ιστικές κατευθύνσεις. Στόχος μας ήταν η καταγραφή ασύμμετρων κυτταρικών και η ανίχνευση ποσοτικών ή ποιοτικών διαφορών στο «µείγµα» Α- και Β-τύπου λαµινών στα θυγατρικά κύτταρα. Τα κύτταρα Ε14 μελετήθηκαν τόσο στηναδιαφοροποίητη όσο και στη διαφοροποιημένη κατάσταση. Κατά τη διάρκεια των διαφοροποιήσεωνπραγματοποιήθηκε ενδελεχής έλεγχος κλασσικών δεικτών για όλα τα στάδια μιας ασύμμετρηςκυτταρικής διαίρεσης και διερευνήθηκαν άλλοι παράγοντες ως προς την συμμετρική ή ασύμμετρηκατανομή τους, μεταξύ των οποίων και οι λαμίνες Α- και Β-τύπου. Πραγματοποιήθηκαν τυχαίες καιστοχευμένες διαφοροποιήσεις τόσο σε δύο όσο και σε τρεις διαστάσεις.Παρατηρήθηκε συστηματικά ότι τα κύτταρα Ε14διαιρούνται πάντοτε με συμμετρικό τρόπο. Επομένως, εστιάσαμε την προσοχή μας σε τυχόν δοµικές ασυµµετρίες, που επηρεάζουν τη µικροαρχιτεκτονική της πυρηνικής λάµινας ή τροποποιούν τη δυναµική συµπεριφορά της, δηλαδή την αντιστρεπτή αποικοδόµηση την οποία υφίσταται αυτή η δοµή κατά τη διάρκεια της µίτωσης. Για να μελετήσουμε με περισσότερη λεπτομέρεια τη δυναμική των πυρηνικών λαμινών, αναπτύξαμε δύο κυτταρικές σειρές στις οποίες υπερεκφράζονται οι πρωτεΐνες αυτές και χρησιμοποιήσαμε την τεχνική FRAP. Έχοντας ως άξονα την καταγραφή κάποιας ασυμμετρίας μεταξύ θυγατρικών κυττάρων, έπρεπε να μελετήσουμε κύτταρα τα οποία είναι μεταξύ τους θυγατρικά και βρίσκονται στην πρώιμη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου, κατά την οποία ανασυγκροτείται ο πυρηνικός φάκελος, και κατά συνέπεια το δίκτυο της πυρηνικής λάμινας. Η σειρά πειραμάτων FRAP πραγματοποιείται στα κύτταρα των σταθερών κυτταρικών σειρών, διαμολυσμένα μέσω ηλεκτροδιαπίδυσης με την φθορίζουσα ιστόνη Η2Β. Τα πειράματα αυτά βρίσκονται σε εξέλιξη