The study of senescence in oral lichen planus with the use of specific lipofuscin stain with sudan black B, an original method for the detection of senescent cells

Cellular senescence (CS) is defined as the irreversible cell cycle arrest attributed either to telomere attrition or to stressful stimuli and is considered a tumor suppressor mechanism. It consists a challenging field of research as it merges natural aging , chronic inflammation and carcinogenesis pathways. To study the phenomenon efficiently as well as quantitatively the in vitro and in vivo identification of senescent cells is essential. The hitherto most reliable biomarker of CS is the detection of Senescence-Associated beta-galactosidase acti vity (SA-β-gal). However, a disadvantage of SA-β-gal is that it is not applicable in formalin fixed paraffin embedded tissue and thus a biomarker of CS also applicable in archival material is currently unavailable. AIM To establish a biomarker of CS with application in archival material. To test this biomarker in Oral Lichen Planus (OLP), which consist a model of inflammatory preneoplastic disease.MATERIALS AND METHODS: We extensively validated the histochemical Sudan Black B (SBB) specific stain of lipofuscin (an aggregate of oxidized proteins lipids and metals) as an additional reliable approach to detect senescent cells independently of sample preparation and origin. Finally, cryo-preserved tissues being SA-β-gal positive were formalin-fixed; paraffin embedded and stained with SBB. We applied this techinique in OLP archival samples and Oral Squamous cell carcinoma (OSCC), oral fibromas and normal oral mucosa.RESULTS Our analyses in a series of different cellular and tissue settings demonstrated co-localization of lipofuscin and SA-β-gal in senescent cells both, in vitro and in vivo (cryo-preserved tissue), strongly supporting the use of lipofuscin as an, additional to SA-β-gal, reliable biomarker of senescent cells. The analyses in cryo-preserved tissues being SA-β-gal positive and formalin-fixed; paraffin embedded revealed that the corresponding SA-β-gal positive tissue areas were specifically stained positive for lipofuscin by SBB, further validating the specificity of lipofuscin SBB staining in depicting senescent cells in archival formalin fixed paraffin embedded tissue material. The latter unique property of SBB could enable the exploitation of widely available retrospective archival material, especially for studying the induction of CS subsequent to anticancer therapy. Also the use of SBB in OLP, OSCC , fibromas and normal oral tissue, revealed the presence of senescent fibroblasts in OLP and fibromas and their absence in OSCC and normal oral tissue. The presence of these cells could be interpreted as a positive stromal reaction to harmul stimuli (inflammation, trauma). This reaction may be permanent and protective when the stimuli is low (trauma –fibromas) and could possibly be abolished when chronic stress (chronic inflammation in OLP) results in severe genomic instability (cancer).Cellular senescence (CS) is defined as the irreversible cell cycle arrest attributed either totelomere attrition or to stressful stimuli and is considered a tumor suppressor mechanism. Itconsists a challenging field of research as it merges natural aging, chronic inflammation andcarcinogenesis pathways. To study the phenomenon efficiently as well as quantitatively the invitro and in vivo identification of senescent cells is essential. The hitherto most reliablebiomarker of CS is the detection of Senescence-Associated beta-galactosidase activity (SA-β-gal). However, a disadvantage of SA-β-gal is that it is not applicable in formalin fixedparaffin embedded tissue and thus a biomarker of CS also applicable in archival material iscurrently unavailable.AIM: To establish a biomarker of CS with application in archival material. To test thisbiomarker in Oral Lichen Planus (OLP), which consists a model of inflammatorypreneoplastic disease.MATERIALS AND METHODS: We extensively validated the histochemical Sudan BlackB (SBB) specific stain of lipofuscin (an aggregate of oxidized proteins lipids and metals) asan additional reliable approach to detect senescent cells, independently of sample preparationand origin. Finally, cryo-preserved tissues being SA-β-gal positive were formalin-fixed;paraffin embedded and stained with SBB. We applied this techinique in OLP archivalsamples and Oral Squamous cell carcinoma (OSCC), oral fibromas and normal oral mucosa.RESULTS: Our analyses in a series of different cellular and tissue settings demonstrated colocalizationof lipofuscin and SA-β-gal in senescent cells both, in vitro and in vivo (cryopreservedtissue), strongly supporting the use of lipofuscin as an, additional to SA-β-gal,reliable biomarker of senescent cells. The analyses in cryo-preserved tissues being SA-β-galpositive and formalin-fixed; paraffin embedded revealed that the corresponding SA-β-gal positive tissue areas were specifically stained positive for lipofuscin by SBB, furthervalidating the specificity of lipofuscin SBB staining in depicting senescent cells in archivalformalin fixed paraffin embedded tissue material. The latter unique property of SBB couldenable the exploitation of widely available retrospective archival material, especially forstudying the induction of CS subsequent to anticancer therapy. Also the use of SBB in OLP,OSCC, fibromas and normal oral tissue, revealed the presence of senescent fibroblasts inOLP and fibromas and their absence in OSCC and normal oral tissue. The presence of thesecells could be interpreted as a positive stromal reaction to harmul stimuli (inflammation,trauma). This reaction may be permanent and protective when the stimuli is low (trauma –fibromas) and could possibly be abolished when chronic stress (chronic inflammation inOLP) results in severe genomic instability (cancer).Ως κυτταρική γήρανση (cellular senescence) ορίζεται η μη αναστρέψιμη παύση του κυτταρικού κύκλου συνεπεία είτε εξάντλησης των τελομερών, είτε κυτταρικού στρες, και θεωρείται μηχανισμός αντίστασης στην καρκινογένεση. Το φαινόμενο της κυτταρικής γήρανσης αποτελεί μια ερευνητική πρόκληση μιας και αποτελεί συνδετικό κρίκο μεταξύ της φυσιολογικής γήρανσης της χρόνιας φλεγμονής και βασικών μονοπατιών της καρκινογένεσης. Ο μέχρι σήμερα πιο αξιόπιστος δείκτης κυτταρικής γήρανσης είναι η ανίχνευση της δραστηριότητας της β- γαλακτοσιδάσης των γηρασμένων κυττάρων ,(senescence-associated-beta-galactosidase SA-β-gal). Η μέθοδος αυτή δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε αρχειακό υλικό (ιστούς εγκιβωτισμένους σε παραφίνη) αλλά μόνο σε φρέσκους ιστούς και σε τομές από άμεσα κατεψυγμένους ιστούς (κρυοτομές). Εξαιτίας αυτού του περιορισμού υπάρχει έλλειψη εκτενών κλινικοπαθολογικών μελετών για την κυτταρική γήρανση.ΣΚΟΠΟΣ : Επιχειρήθηκε η αναζήτηση ενός βιολογικού δείκτη κυτταρικής γήρανσης, με εφαρμογή σε αρχειακό υλικό. Επίσης, μελετήθηκε η πρωτότυπη χρησιμοποίησή του ως δείκτη κυτταρικής γήρανσης σε ένα χρόνιο φλεγμονώδες νόσημα που αποτελεί μοντέλο συσχέτισης χρόνιας φλεγμονής και καρκίνου, τον Ομαλό λειχήνα του στόματος.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ : Αναζητώντας μια μέθοδο ανίχνευσης γηρασμένων κυττάρων εφαρμόσιμη σε αρχειακό υλικό, αξιολογήσαμε την ιστοχημική χρώση Sudan-Black B (SBB), που είναι ειδική για την ανίχνευση της λιποφουσκίνης. Η λιποφουσκίνη είναι ένα συσσωμάτωμα οξειδωμένων πρωτεϊνών, λιπιδίων και μετάλλων, η οποία συσσωρεύεται σε γηρασμένους ιστούς. Αναλύσαμε κυτταρικά συστήματα στα οποία προκλήθηκε κυτταρική γήρανση είτε ύστερα από εξάντληση του πολλαπλασιασμού (replicative senescence) ή από στρεσογόνα ερεθίσματα, προ-καρκινικές αλλοιώσεις σε υπό προϋποθέσεις knock-in ποντίκια που παρουσιάζουν γήρανση, και τέλος σε ανθρώπινες προκαρκινικές αλλοιώσεις που γνωρίζουμε ότι περιέχουν γηρασμένα κύτταρα. Η τεχνική εν συνεχεία εφαρμόστηκε σε δείγματα Ομαλού λειχήνα, Ακανθοκυτταρικού καρκινώματος στόματος , καλοήθεις βλάβες στοματικού βλεννογόνου (ινώματα) και φυσιολογικού στοματικού βλεννογόνου.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ : Στα παραπάνω πειράματα αποδείξαμε την συνταύτιση της λιποφουσκίνης και του SA-β-gal σε in vitro και in vivo γηρασμένα κύττταρα (κατεψυγμένους ιστούς). Tα ευρήματα αυτά συνηγορούν πως η λιποφουσκίνη είναι ένας ικανός υποψήφιος δείκτης κυτταρικής γήρανσης. Επιπρόσθετα, κατεψυγμένοι ιστοί θετικοί για SA-β-gal μονιμοποιήθηκαν σε φορμόλη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη και βάφτηκαν με SBB. Οι αντίστοιχες SA-β-gal θετικές περιοχές στον ιστό βάφτηκαν ειδικά για λιποφουσκίνη με SBB, ενώ οι ιστοί που ήταν αρνητικοί για SA-β-gal βρέθηκαν και αρνητικοί για τη λιποφουσκίνη. Τα ευρήματα αυτά ενισχύουν περαιτέρω την ευαισθησία και την ειδικότητα της SBB χρώσης για την ανάδειξη γηρασμένων κυττάρων σε αρχειακό υλικό. Η τελευταία μοναδική ιδιότητα του SBB μπορεί να αξιοποιηθεί για κλινικοπαθολογικές μελέτες στο ευρέως διαθέσιμο αρχειακό υλικό. Επιπρόσθετα, η εφαρμογή της τεχνικής σε τομές παραφίνης από Ομαλό λειχήνα, Ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα σε ινώματα και φυσιολογικό ιστό στόματος, ανέδειξε την παρουσία γηρασμένων ινοβλαστών στις τομές των ινωμάτων και του Ομαλού λειχήνα και την απουσία τους στο φυσιολογικό ιστό και το Ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του στόματος. Τα ευρήματα αυτά συνηγορούν υπερ μιας προστατευτικής δράσης αυτών των κυττάρων , πιθανά στα πλαίσια μιας καλοήθους αντίδρασης του στρώματος