Ανίχνευση του οροεπιπολασμού των polyomaviruses, herpesviruses & helicobacter pylori σε πρώιμες ηλικίες και η συσχέτισή του με επιπτώσεις στην υγεία των παιδιών: προοπτική μελέτη μητέρας-παιδιού Κρήτης, μελέτη ΡΕΑ

Introduction: During the first years of life, children are constantly confronted to a number of infections. Clinically evident infections have been a subject of research for many years, enabling development of successful prevention programs (e.g., vaccination programs). Nonetheless, children subclinically acquire a number of other infections whose role in health and disease has been little examined. It has been suggested that a normal course of infections in early life protects against the development of childhood leukemia (the Greaves hypothesis) and of chronic inflammatory disorders (the hygiene or “old friends” hypothesis). Nonetheless, these hypotheses are based on epidemiological studies which use proxy variables such as age of first school attendance, to denote exposure to common infections. Very limited prospective data exist on characterizing this repertoire of common infections in childhood by use of biological measures.The primary objective of this study has been the description of the seroepidemiology of Polyomaviruses and Herpesviruses in early childhood. Polyomaviruses are DNA viruses (fourteen known so far), which are largely acquired subclinically in early life. Studies in adults show high seroprevalence rates but the exact age of acquisition is not known. Herpesviruses are also largely acquired in childhood with the exception of HSV-2, which is predominantly acquired through sexual contact later in life. Emerging data suggest that recent changes in family structure, childrearing, and hygiene practices have modified the epidemiology of Herpesviruses. This might have important public health implications as the timing of exposure has a critical role in the outcome of infection with Ηerpesviruses. These facts highlight the importance of studying the seroepidemiology of Polyomaviruses and Herpesviruses in early life in the general population.The next objective has been to explore the role of Polyomaviruses and Herpesviruses infections in child’s neurodevelopment and growth. The developing brain is extremely sensitive to the neuroinflammation induced by viruses. Among Polyomaviruses, JCPyV is known to be neurotropic and is the etiologic agent of progressive multifocal leukoencephalopathy, a fatal demyelinating disease of the central nervous sytem occurring mainly in immonocompromised individuals. Moreover, Lintas et al. foundenhanced frequencies of Polyomaviruses (BKPyV, JCPyV, SV40) in postmortem neocortical tissues of autistic patients, raising questions for an association between Polyomaviruses and autism. EBV, CMV and HSV-1, members of the Herpesviruses family, are also neurotropic viruses and under certain circumstances can infect the central nervous system and cause acute encephalitis/meningitis and long-term neurological sequelae (e.g., sensorineural hearing loss due to congenital CMV infection). The potential association of Polyomaviruses and Herpesviruses with child’s growth, obesity and cardiometabolic traits is less evident but is based on an emerging hypothesis of an infectious origin of obesity. In particular, adenovirus 36 has been associated with obesity both in animal and human studies. Moreover a metabolic dysfunction has been shown to accompany some viral infections such as CMV, HSV-1 and HSV-2. Interestingly, an increasing number of studies report a link between pathogen burden, obesity, cardiometabolic traits and disease, but no evidence exists in childhood. Lastly, an objective of the present study has been to describe the seroepidemiology of Helicobacter pylori, a very common chronic bacterial infection in humans which is associated with increased risk for gastric cancer. A wealth of evidence strongly implicates Helicobacter pylori infection in the pathogenesis of extragastric diseases such as idiopathic thrombocytopenic purpura, unexplained iron-deficiency anemia and vitamin B12 deficiency. Moreover, an increasing number of studies report an association between Helicobacter pylori and neuropsychiatric diseases such as Parkinon’s and Alzheimer. It is likely that an association with neurodevelopment is evident already in early life, but there are no data. Thus, we hypothesized that Helicobacter pylori infection during the first years of life but also maternal Helicobacter pylori infection during pregnancy may unfavorably affect offspring’s neurodevelopment through micronutrients deficiencies (e.g folate, B12). Fetal brain is extremely vulnerable to such micronutrients defects. To the best of our knowledge, no study has examined differences in neurodevelopment between children of Helicobacter pylori seropositive versus seronegative mothers.Specific Objectives: • To describe the seroprevalence of Polyomaviruses, Herpesviruses and Helicobacter pylori in early life using repeated samples collected at birth (cord blood), three years and four years of age. • To identify the factors – sociodemographic, perinatal, variables denoting social interactions, lifestyle, hygiene practices- that determine the acquisition of Polyomaviruses and Herpesviruses up to four years of age. • To explore the association between seropositivity to single and multiple Polyomaviruses and Herpesviruses up to age four with neurodevelopmental assessment of children at the same age.• To explore the association between Helicobacter pylori infection early in life including fetal life with neurodevelopment of children at age four.• To explore the association between seropositivity to single and to multiple Polyomaviruses and Herpesviruses up to age four with obesity and cardiometabolic traits at age four and six.Methods: This study uses data from the Rhea study a birth cohort that recruited 1,606 pregnant women from February 2007 to January 2008 (www.rhea.gr). The inclusion criteria were confirmed pregnancy, residency within the study area, aged 16 years or older, and good understanding of the Greek language. Recruitment occurred mostly before 15 weeks of gestation. Mothers were contacted again at 24 weeks of gestation, at birth, and for child’s follow-up at 9th month, 18th month, 4 years, and 6 years of age. When members of the cohort were 3 years of age, we invited a randomly selected subsample for a serological assessment (n = 109).Blood samples collected at birth (cord blood) and at 3 and 4 years of age were processed following standard procedures and then stored at −80°C. Serum aliquots of 100 μL were shipped on dry ice to the German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany, for serological analysis. Immunoglobulin G seroreactivity against the viral capsid protein 1 of ten Polyomaviruses (BKPyV, JCPyV, KIPyV,WUPyV,MCPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9, HPyV10), four EBV antigens (ZEBRA, EBNA-1, EA-D, VCA p18), five CMV antigens (pp52, pp65, pp150, pp28, CM2), one HSV-1 antigen (gG), one HSV-2 antigen (mgGunique), four HHV-8 antigens (LANA, v-cyclin, K8.1, ORF-65) and twelve H.pylori proteins (GroEL, UreA, HP0231, NapA, HP0305, HpaA, CagA, HyuA, catalase, VacA, HcpC, Omp) was measured by fluorescent bead-based multiplex serology (1:1,000 dilution). Of note, immunoglobulin G levels in cord blood reflect the mother’s immunoglobulin G levels. Seropositivity for a given antigen was defined as median fluorescence intensity values greater than the antigen- specific cut off. EBV and CMV seropositivity was defined as seropositivity for at least two virus specific antigens. Seropositivity for a given Helicobacter pylori protein was defined as seroreactivity greater than the protein-specific cut-off which was re-evaluated using the published reference panel. The aggregate number of different Polyomaviruses that the children were seropositive to was referred as Polyomaviruses burden. Similarly, we calculated the Herpesviruses burden.Information on potential determinants of seroprevalence of polyomaviruses and herpesviruses is based on repeated questionnaires from birth to 4 years of age. Children’s cognitive and motor development was assessed by two trained psychologists with the McCarthy Scales of Children’s Abilities (MSCA). Additional information on children’s behavior was obtained via maternal report on standardized child behavior scales, which were administered at the 4 years of age follow-up. The Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder Test (ADHDT) is designed to identify and evaluate ADHD in ages 3–23 years. The parent version of the Strengths and Difficulties Questionnaire (SDQ) is a behavioral screening instrument designed to assess strengths and difficulties of children aged 3–16 years. We measured body mass index, waist circumference and skinfold thickness at four anatomical sites at four and six years of age. At age six hand-to-leg bioelectrical impendence was also measured using a Bodystat 1500 machine. Data on metabolic traits including serum lipids, leptin and adiponectin levels were also available.Descriptive analyses of the study population characteristics, exposures and outcomes were conducted. Multiple linear, logistic and Poisson regression models were used to explore the associations accordingly.Results: 1) Seroprevalence of Polyomaviruses ranged from 38.5% to 99.8% in cord blood and from 20.9% to 82.3% at age 4. Seroprevalence of EBV, CMV, HSV-1, HSV-2 and HHV-8 was 99.4%, 74.9%, 26.2%, 8.0%, and 1.6% in cord blood and 52.5%, 25.8%, 3.6%, 1.4%, and 0% at age 4, respectively. Determinants of seropositivity at age 4 were cord seropositivity (JCPyV, HPyV7, HPyV10, CMV), vaginal delivery (HPyV10), breastfeeding (CMV), younger age at day-care entry (BKPyV, KIPyV, WUPyV, TSPyV, HPyV10, HPyV9, EBV, CMV), and swimming pool attendance (BKPyV, KIPyV, WUPyV, HPyV10). Televisionviewing, parental stress, and hygiene practices were inversely associated with the seroprevalence of Polyomaviruses and Herpesviruses.2) Based on crosss-ectional data at age four, we investigated the association between seropositivity to single or multiple Polyomaviruses and Herpesviruses with child’s neurodevelopment and behavior among 674 children. Seropositivity to BKPyV, a potential neurotropic virus, was associated with higher score in ADHDT inattention subscale. Moreover, children seropositive to ≥8 polyomaviruses had lower score in ADHDT inattention subscale and lower score in SDQ hyperactivity–inattention subscale versus children seropositive to ≤3 Polyomaviruses.3) H.pylori seroprevalence in cord blood, representing maternal status, was 41.5% and in children four years of age was 6.5%. Children of Helicobacter pylori seropositive mothers compared to those of seronegative mothers, had lower score in all scales of the MCSA excluding motor scale. In addition, seropositivity in cord blood specifically to GroEl and NapA – two of the 12 Helicobacter pylori proteins investigated – was associated with statistically significant lower scores in almost all scales of MCSA. At age four, Helicobacter pylori seropositive children performed worst in neurodevelopment assessment compared to their seronegative counterparts although no association reached statistically significant level.4) Based on cross-sectional data of 674 children participating at the 4 years of age follow-up and prospective data of 440 children at age six, we investigated the association of seropositivity to single or multiple Polyomaviruses and Herpesviruses with child’s obesity and cardiometabolic traits at the corresponding ages. BKPyV seropositivity was associated with lower BMI, waist circumference, sum of skinfolds and lower leptin levels at age four and with lower BMI, waist circumference and %body fat at age six. On the other hand, CMV seropositivity was associated with higher BMI at age four and six and higher sum of skinfolds at age six. Moreover, children with “2-3 Herpesviruses infections” versus those with “0 Herpesviruses infections” had higher BMI SD-score, waist circumference and sum of skinfolds at age four.Conclusions: In summary, findings of the present thesis describe the natural history of acquisition of ten Polyomaviruses (BKPyV, JCPyV, KIPyV, WUPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, MCPyV, HPyV9 and HPyV10), five Herpesviruses (EBV, CMV, HSV-1, HSV-2, HHV-8) and Helicobacter pylori in a population of young healthy children which are prospectively followed in the Rhea mother-child cohort in Crete. To the best of our knowledge, there is no previous report gathering such detailed information on seroprevalence to those common infections. We have shown that, by age 4, children were commonly seropositive to Polyomaviruses and Herpesviruses, with the exceptions of HHV-8, HSV-1 and HSV-2. Seroprevalence to Helicobacter pylori was low and in accordance with reports from other western populations. The resent analysis provides important insights into the factors that determine the acquisition of such common infections by age four. For example, younger age at day-care entry importantly contributed in the epidemiology of BKPyV, KIPyV, WUPyV, TSPyV, HPyV10, HPyV9,EBV, and CMV while there was as strong socioeconomic position patterning of Polyomaviruses seroprevalence at age four. Such findings are important allowing inference on potential routes of transmission for those viruses among young children.Intriguing are the findings regarding the association of Polyomaviruses and Herpesviruses infections with child’s neurodevelopment. The inverse association between the number of Polyomaviruses infections acquired up to age four with symptoms of inattention and hyperactivity might indicate not only potential interaction between the immune system and the developing brain but also a different pattern of acquisition of such common infections among children with such behaviours. From a public health perspective, it is particularly important the finding that children of Helicobacter pylori seropositive mothers had worst neurodevelopmental performance at age four, raising questions on whether treatment for Helicobacter pylori could prevent such an outcome. Finally, we observed very strong associations for BKPyV and CMV with obesity and cardiometabolic traits in childhood. Similar findings have not been reported in children and should be replicated in other populations.Εισαγωγή: Τα πρώτα χρόνια της ζωής, τα παιδιά εκτίθενται συνεχώς σε λοιμώξεις. Οι λοιμώξεις που συνοδεύονται από κλινικές εκδηλώσεις έχουν μελετηθεί συστηματικά και έχουν οδηγήσει στην ανάπτυξη αποτελεσματικών μέτρων πρόληψης, όπως ο εμβολιασμός. Ωστόσο, ο ρόλος των κοινών λοιμώξεων στην υγεία και τη νόσο έχει ελάχιστα μελετηθεί. Υπάρχουν υποθέσεις που υποστηρίζουν ότι μια φυσιολογική πορεία έκθεσης σε λοιμώξεις στην παιδική ηλικία αποτελεί προστατευτικό παράγοντα για την ανάπτυξη της παιδικής λευχαιμίας (η υπόθεση του Greaves) καθώς και για την ανάπτυξη χρόνιων φλεγμονώδων νοσημάτων (η υπόθεση της υγιεινής). Παρόλα αυτά οι υποθέσεις αυτές βασίζονται σε μελέτες που η έκθεση σε κοινές λοιμώξεις εκφράζεται με μεταβλητές όπως η ηλικία έναρξης του σχολείου. Ελάχιστες προοπτικές μελέτες υπάρχουν που να περιγράφουν τη φυσική πορεία έκθεσης σε πολλές κοινές λοιμώξεις ταυτόχρονα τα πρώτα χρόνια της ζωής, χρησιμοποιώντας βιολογικούς δείκτες, για παράδειγμα μετρώντας την ανοσολογική απάντηση.Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε αρχικά η περιγραφή της έκθεση στην παιδική ηλικία στους Polyomaviruses και Herpesviruses. Οι Polyomaviruses αποτελούν μια ομάδα DNA ιων που προσβάλουν τον άνθρωπο (δεκατέσσερις γνωστοί μέχρι σήμερα) και φαίνεται να αποκτώνται νωρίς στη ζωή, προκαλώντας υποκλινική νόσο. Μελέτες σε ενήλικες έχουν δείξει πολύ υψηλά ποσοστά οροεπιπολασμού ωστόσο δεν είναι γνωστή η συνήθης ηλικία ορομετατροπής. Οι Herpesviruses αποκτώνται συνήθως στην παιδική ηλικία με εξαίρεση τον HSV-2 που αποκτάται αργότερα στη νεαρή ενήλικο ζωή με την έναρξη της σεξουαλικής δραστηριότητας. Νεότερα δεδομένα δείχνουν ότι η επιδημιολογία των Herpesviruses έχει αλλάξει σημαντικά και η ορομετατροπή έχει μετατεθεί σε μεγαλύτερες ηλικίες, πιθανά λόγω αλλαγών που έχουν επισυμβεί στον τρόπο ζωής όπως η σύνθεση της οικογένειας και οι τρόποι ανατροφής των παιδιών. Τα παραπάνω υποσημαίνουν την αξία μελέτης του οροεπιπολασμού των Polyomaviruses και Herpesviruses τα πρώτα χρόνια ζωής στο γενικό πληθυσμό. Επόμενο σημαντικό ερώτημα της παρούσας διατριβής αποτέλεσε κατά πόσο οι Polyomaviruses και Herpesviruses σχετίζονται με την νευροανάπτυξη και την σωματική ανάπτυξη στα πρώτα χρόνια ζωής στο γενικό πληθυσμό. Το αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο στην φλεγμονή που προκαλείται απο ιογενείς λοιμώξεις. Από τους Polyomaviruses, o JCPyV είναι νευροτρόπος ιός και ευθύνεται για την προοδευτική πολυεστιακή λευκοεγκεφαλοπάθεια σε ανοσοκατεσταλμένα άτομα. Επίσης σε μία μελέτη ασθενών-μαρτύρων, απομονώθηκαν οι BKPyV, JCPyV και SV40 σε εγκεφαλικό ιστό ατόμων με αυτισμό. Από τους Herpesviruses που μελετήσαμε, οι EBV, CMV και HSV-1 είναι δυνητικά νευροτρόποι ιοί και κάτω από ορισμένες συνθήκες μπορούν να οδηγήσουν σε εγκεφαλίτιδα/μηνιγγίτιδα καθώς και μακροπρόσθεσμες νευρολογικές επιπτώσεις, για παράδειγμα σε νευροαισθητήρια απώλεια της ακοής μετά από συγγενή λοίμωξη με CMV. Η πιθανή σχέση των Polyomaviruses και Herpesviruses με την σωματική ανάπτυξη, την παχυσαρκία και καρδιαγγειακούς δείκτες στην παιδική ηλικία είναι λιγότερο προφανής, ωστόσο στηρίζεται σε μια νεότερη υπόθεση ότι οι λοιμώξεις μπορεί να οδηγούν σε παχυσαρκία μέσω διαφόρων μηχανισμών που υποδεικνύονται από μελέτες σε ζώα. Συγκεκριμένα, ο αδενοϊός 36, που αποκτάται στην παιδική ηλικία, έχει συσχετιστεί με την παχυσαρκία σε μελέτες σε ανθρώπους και ζώα. Επίσης υπάρχουν αναφορές για τη σχέση των CMV, HSV-1, HSV-2 με καρδιαγγειακούς δείκτες ωστόσο τα δεδομένα αυτά είναι περιορισμένα. Τα τελευταία χρόνια αυξάνονται επίσης οι αναφορές για τη σχέση του αριθμού των λοιμώξεων που έχει εκτεθεί ο άνθρωπος (pathogen burden) με την παχυσαρκία και άλλους καρδιαγγειακούς δείκτες, ωστόσο δεν υπάρχουν δεδομένα στην παιδική ηλικία. Τέλος, αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε ο καθορισμός του οροεπιπολασμού του Helicobacter pylori, ενός κοινού παθογόνου για τον άνθρωπο που σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για γαστρικό καρκίνο. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι αυξανόμενες αναφορές για τη σχέση του Helicobacter pylori με εξωγαστρικές εκδηλώσεις όπως η ιδιοπαθής θρομβοπενική πορφύρα, η σιδηροπενική αναιμία και η Β12 ανεπάρκεια. Παράλληλα, υπάρχουν αναφορές σε ενήλικες που συσχετίζουν το Helicobacter pylori με νευροψυχιατρικά νοσήματα όπως η νόσος Alzheimer και Parkinson. Πιθανά παρόμοια συσχέτιση να υπάρχει και στην παιδική και εφηβική ηλικία ωστόσο δεν υπάρχουν σχετικές αναφορές. Υποθέσαμε ότι η λοίμωξη από Helicobacter pylori νωρις στη ζωή, ακόμα και κατά την ενδομήτριο ζωή, μπορεί να οδηγήσει σε δυσμενή νευροαναπτυξιακή εξέλιξη, μέσω μικροθρεπτικών ελλείψεων (π.χ. σε φυλλικό, B12) που φαίνεται να προκαλεί η λοίμωξη από Helicobacter pylori. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε λοιπόνσυγκεκριμένα η σχέση της οροθετικότητας στο Helicobacter pylori στις μητέρες στο τέλος της κύησης και των παιδιών στα 4 έτη με τη νευροαναπτυξη των παιδιών στα 4 έτη.Ειδικοί Στόχοι: • Να περιγράψουμε τον οροεπιπολασμό των Polyomaviruses, Herpesviruses και Helicobacter pylori νωρίς στη ζωή, χρησιμοποιώντας επαναλαμβανόμενα δείγματα αίματος που συλλέχθησαν στη γέννηση (ομφαλικό αίμα), στα 3 έτη και στα 4 έτη.• Να περιγράψουμε τους παράγοντες- κοινωνικο-οικονομικούς, περιγεννητικούς, κοινωνικών επαφών, τρόπου ζωής, προσωπικής υγιεινής- που επιδρούν στην ορομετατροπή στους Polyomaviruses και Herpesviruses εως την ηλικία των 4 ετών.• Να μελετήσουμε τη σχέση της έκθεσης σε ένα ή και περισσότερους Polyomaviruses και Herpesviruses εως την ηλικία των 4 ετών με τη νευροαναπτυξη των παιδιών στην ίδια ηλικία.• Να μελετήσουμε τη σχέση της λοίμωξης με Helicobacter pylori νωρίς στη ζωή, συμπεριλαμβανομένου της ενδομήτριου ζωής, με τη νευροανάπτυξη των παιδιών στην ηλικία των 4 ετών.• Να μελετήσουμε τη σχέση της έκθεσης σε ένα ή και περισσότερους Polyomaviruses και Herpesviruses εως την ηλικία των 4 ετών με την παχυσαρκία και καρδιαγγειακούς δείκτες στα 4 και 6 έτη ζωής.Μεθοδολογία: Ο πληθυσμός της παρούσας διατριβής προέρχεται από τη μελέτη Μητέρας Παιδιού Κρήτης, Μελέτη ΡΕΑ (www.rhea.gr) και περιλαμβάνει ένα δείγμα περίπου 1,000 εγκύων γυναικών (Ελληνίδων και αλλοδαπών) και των παιδιών τους για τις οποίες ο τοκετός πραγματοποιήθηκε σε ένα από τα νοσοκομεία του νομού Ηρακλείου (δημόσια & ιδιωτικά) κατά τη χρονική περίοδο ενός έτους (Μάρτιος 2007-Φεβρουάριος 2008). Οι γυναίκες αυτές προσεγγίστηκαν τη 12η -14η και την 28η -32η εβδομάδα κύησης και τον τοκετό και ακολούθησε παρακολούθηση των παιδιών με συνάντηση στους 6 μήνες ζωής, στα 4 χρόνια και στα 6 χρόνια. Σε ένα τυχαίο δείγμα του πληθυσμού μας έγινε συνάντηση και στα 3 χρόνια ζωής για τους σκοπούς της παρούσας ορολογικής μελέτης.Δείγματα αίματος που συλλέχθηκαν στη γέννηση (ομφαλικό αίμα) (n=626), 3 χρόνια (n=81) και 4 χρόνια (n=690) και είχαν αποθηκευθεί στους -80˚C, στάλθηκαν για ορολογική ανάλυση στο εργαστήριο, Molecular Diagnostics of Oncogenic Infections Department, Infection and Cancer Program, German Cancer Research Center (DKFZ) της Γερμανίας. Η IgG οροαντιδαστικότητα που μετρήθηκε αφορούσε το αντιγόνο VP1 για τους 12 Polyomaviruses (BKPyV, JCPyV, KIPyV, WUPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, MCPyV, HPyV9 and HPyV10), τέσσερα EBV αντιγόνα (ZEBRA, EBNA-1, EA-D, VCA p18), πέντε CMV αντιγόνα (pp52, pp65, pp150, pp28, CM2), ένα HSV-1 αντιγόνο (gG), ένα HSV-2 αντιγόνο (mgGunique), τέσσερα HHV-8 αντιγόνα (LANA, V-CYCLIN, K8.1, ORF-65) και δώδεκα Helicobacter pylori αντιγόνα (GroEL, UreA, HP0231, NapA, HP0305, HpaA, CagA, HyuA, catalase, VacA, HcpC, Omp). Σημειώνεται ότι η οροαντιδραστικότητα στα δείγματα ομφαλικού αίματος αντιπροσωπεύει την οροαντιδραστικότητα των μητέρων στο τέλος της κύησης. Η οροθετικότητα για κάθε αντιγόνο ορίστηκε χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα όρια που στην περίπτωση των Polyomavi