Effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) on subpopulations of lymphocytes in ovarian cancer

INTRODUCTIONEpithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death among gynecological malignancies and the fourth most common cause of cancer-related deaths among women. Recent data suggest that VEGF contributes to tumor growth not only by promoting angiogenesis but also by an indirect mechanism of regulation of T cells involved in the immune response against the tumor. T cells are pivotal in the induction and progression of the anti-tumor immune reaction in many types of cancer, including ovarian carcinomas and cancer patients demonstrate impaired T-cell functions. In previous studies of the Department of Clinical Therapeutics of university of Athens, has been demonstrated that the levels of VEGF in the ascitic fluid was an independent adverse prognostic factor in a cohort of 65 patients with advanced ovarian cancer and were inversely correlated with immunologically important T-cell subpopulations, such as CD3+CD56+ NK-like T cells. These results were indicative of an additional immunosuppressive function exerted by this factor. Nevertheless, the direct effect of VEGF on T cells as well as the mechanisms underlying such actions has not been studied yet.AIMThe aim of the present thesis is to study the possible direct effect of vascular endothelial growth factor (VEGF) on T cells subpopulations of ovarian cancer patients.MATERIALS AND METHODSAscitic fluids and peripheral blood samples were collected in heparinized tubes from over 25 patients who had undergone surgery in the Ά Department of Obstetrics and Gynecology of university of Athens and their histological exam reported epithelial ovarian cancer. In the publication of the study were included samples from 15 ovarian cancer patients and peripheral blood samples from 10 healthy donors. The study protocol had appropriate IRB approval and all subjects gave their informed consent for the collection of the samples. T cells isolated from the biological samples were expanded in cultures for 14 days, with or without VEGF and the number of viable T cells were counted. The expression of VEGF receptors was assayed by flow cytometry, immunocytochemistry and Western blotting Cultured T cells were also tested for their cytotoxic activity in a standard 4-hr 51Cr-release assay, and to assess the ability of activated T cells to secrete VEGF, levels in culture supernatants were measured by enzyme linked immunosorbent assay.RESULTS-DISCUSSIONDue to the size of the study and the clinical significance of the results it was decided to separate the publication of the results. The first publication regards to the effect of VEGF on lymphocytes isolated from the peripheral blood of patients with ovarian cancer and healthy donors and the second one regards to the effect of VEGF on lymphocytes isolated from ascetic fluid of patients with ovarian cancer.The results regarding the effect of vascular endothelial growth factor on lymphocytes isolated from peripheral blood of ovarian cancer patients and healthy donors were published in February 2012 in International Journal of Cancer. Briefly, we demonstrated a significant inhibitory effect of VEGF on the proliferation of T cells derived from peripheral blood lymphocytes. This effect was time- and dose-dependent and was similar among the cancer patient and healthy donor-derived cell cultures. CD3+ T cells expressed VEGFR-2 on their surface upon activation. This was confirmed by flow cytometry, immunocytochemistry and western blotting analysis. We also showed that VEGF suppresses T cell proliferation through VEGFR-2, as the addition of anti-VEGFR-2 mAb fully restored the VEGF-induced suppression of T cell proliferation both in cancer patient and healthy donor-derived cell cultures. Furthermore, we showed that VEGF significantly reduced the cytotoxic activity of T cells against K562 and Daudi-target cells. Moreover, we demonstrated that activated T cells have the ability to secrete VEGF in their culture environment. Overall, this study showed that T cells secret VEGF and expresses VEGFR-2 upon activation and VEGF directly suppresses T cell activation via VEGF receptor type 2.We believe that this publication provided the research community with the insight of a mechanism of T cell suppression in the context of excessive production of VEGF, such as malignant conditions. We show that this suppression is mediated through the expression of VEGFR-2 on T cell surface. The translational consequence of the above is that VEGF may be a marker not only for angiogenesis but it may also play a direct suppressive role on T cells and more specifically on cells of the immune system that are involved in fighting cancer. The production of low amounts of VEGF by T cells may contribute to local angiogenesis under physiological conditions. These results underline the pleiotropic actions of VEGF in carcinogenesis and cancer progression and strengthen its prognostic importance in ovarian cancer. They are clinically relevant particularly after recent reports suggesting a benefit by the addition of an anti-VEGF monoclonal antibody to chemotherapy for advanced ovarian cancer.The results regarding the effect of vascular endothelial growth factor on lymphocytes isolated from ascitis of ovarian cancer patients were published in November 2012 in British Journal of Cancer. Briefly, we demonstrated that the addition of VEGF in cultures significantly reduced the number and proliferation rate of T cells. This effect was time- and dose-dependent. CD3+ T cells expressed VEGFR-2 on their surface upon activation. This was confirmed by flow cytometry, immunocytochemistry and western blotting analysis. We also showed that VEGF suppresses T cell proliferation through VEGFR-2, as the addition of anti-VEGFR-2 mAb fully restored the VEGF-induced suppression of T cell proliferation. Furthermore, we showed that VEGF significantly reduced the cytotoxic activity of T cells against K562 and Daudi-target cells and against autologous cancer cells isolated from the ascetic fluid of the cancer patients. Moreover, we demonstrated that activated T cells have the ability to secrete VEGF in their culture environment. In summary, this study showed that T cells isolated from the ascites of ovarian cancer patients secret VEGF and expresses VEGFR-2 upon activation and VEGF directly suppresses T cell activation via VEGF receptor type 2. This publication confirmed the findings of the previous one and provided the research community with new knowledge of a mechanism of T cell suppression in the context of excessive production of VEGF, such as ascetic fluid of ovarian cancer patients. There is importance to mention that suppressive VEGF levels were similar to those measured in the ascites in this study as well as in a previous larger cohort of advanced ovarian cancer patients of Department of Clinical Therapeutics. It is also of importance to stress here, that the action of T cells against autologous cancer cells is a major feature of this study compared with our previous publication. In summary, we have demonstrated for the first time that T lymphocytes derived from ovarian cancer patients’ ascites secrete VEGF and express VEGFR-2 on their surface in response to their activation. This in turn, promotes the suppression of activated T cells by the VEGF produced by the tumour, thus suggesting an immunosuppressive effect. These findings may have clinical relevance, particularly after recent results suggesting a benefit by the addition of the anti-VEGF monoclonal antibody, bevacizumab, to chemotherapy for advanced ovarian cancer. The rationale is that anti-VEGF and/or VEGFR-2 therapies may target not only angiogenesis but also tumor escape from immune surveillance. If this is true, the degree of the effect of VEGF on the immune system may be used to select patients likely to benefit from such approaches.ΕΙΣΑΓΩΓΗΟ επιθηλιακός καρκίνος των ωοθηκών είναι η πρώτη αιτία θανάτου από γυναικολογικό καρκίνο και η τέταρτη αιτία θανάτου από καρκίνο συνολικά στο γυναικείο πληθυσμό. Πρόσφατα δεδομένα προτείνουν πως ο VEGF συμβάλλει στην ανάπτυξη του όγκου όχι μόνο με το να προωθεί την αγγειογέννεση αλλά επίσης μ’ έναν έμμεσο μηχανισμό ρύθμισης των T κυττάρων που εμπλέκονται στην ανοσολογική απάντηση απέναντι στον όγκο. Τα Τ-κύτταρα είναι ο κύριος παράγων στην έναρξη και πρόοδο της ανοσολογικής απάντησης απέναντι στον όγκο σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων και των καρκινωμάτων της ωοθήκης και οι καρκινοπαθείς ασθενείς εμφανίζουν εξασθενημένη ανοσολογική λειτουργία. Σε προηγούμενες μελέτες της Αιματολογικής-Ογκολογικής Μονάδος της Θεραπευτικής Κλινικής έχει αποδειχθεί ότι τα επίπεδα του VEGF στο ασκιτικό υγρό ήταν ένας ανεξάρτητος αρνητικός προγνωστικός παράγοντας σε μια μελέτη τύπου cohort, 65 ασθενών με προχωρημένο επιθηλιακό καρκίνο ωοθηκών και δείχθηκε πως συσχετίζονταν αντίστροφα με ορισμένους κυτταροτοξικούς υποπληθυσμούς όπως τα CD3+CD56+ NK-like T κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά είναι ενδεικτικά της επιπρόσθετης ανοσοκατασταλτικής λειτουργίας αυτού του παράγοντα. Ωστόσο, η πιθανή άμεση επίδραση του VEGF στην ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων καθώς και ο τρόπος που αυτή συμβαίνει δεν έχει διευθετηθεί.ΣΚΟΠΟΣΣκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η επίδραση του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF) στους υποπληθυσμούς των λεμφοκυττάρων ασθενών με καρκίνο ωοθηκών.ΑΣΘΕΝΕΙΣ-ΜΕΘΟΔΟΙ Για τις ανάγκες της μελέτης συλλέχθησαν δείγματα ασκιτικής συλλογής από πάνω από 25 γυναίκες που χειρουργήθηκαν στην Α’ Μαιευτική Γυναικολογική Κλινική του Νοσοκομείου Αλεξάνδρα με ιστολογικά επιβεβαιωμένο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών καθώς και τα αντίστοιχα δείγματα αίματος των ασθενών αυτών από τα οποία χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από 15 ασθενείς κατά την δημοσίευση των αποτελεσμάτων . Επίσης, έχουν ληφθεί και 10 δείγματα αίματος από υγιείς γυναίκες δότριες. . Όλες οι ασθενείς έχουν ενυπόγραφα συγκατατεθεί για την λήψη βιολογικού υλικού. Αφού απομονώθηκαν τα λεμφοκύτταρα από τα δείγματα βιολογικών υγρών αναπτύχθηκαν σε καλλιέργειες για 14 ημέρες με την προσθήκη η μη του VEGF και μετρήθηκε ο αριθμός τους. Τα κύτταρα ελέχθησαν ως προς την έκφραση των υποδοχέων του VEGF με κυτταρομετρία ροής ανοσοϊστοχημεία και Western Blot,ως προς την κυτταροτοξικότητα τους με δοκιμασία απελευθέρωσης 51Cr και ως προς την έκκριση VEGF με ELISA.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑΛόγω του μεγέθους της μελέτης καθώς και της κλινικής σημαντικότητας των αποτελεσμάτων αποφασίστηκε η ξεχωριστή δημοσίευση των αποτελεσμάτων αρχικά όσον αφορά την επίδραση του VEGF σε λεμφοκύτταρα που απομονώθηκαν από το αίμα ασθενών με καρκίνο ωοθηκών και υγιών δοτριών και αργότερα όσον αφορά την επίδραση του VEGF σε λεμφοκύτταρα που απομονώθηκαν από το ασκιτικό υγρό ασθενών με καρκίνο ωοθηκών. Τα αποτελέσματα που αφορούν την επίδραση του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου στους υποπληθυσμούς των λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος ασθενών και υγιών δημοσιεύθηκαν το Φεβρουάριο του 2012 στο περιοδικό International Journal of Cancer. Εν συντομία, δείχθηκε πως η προσθήκη του VEGF στις καλλιέργειες των Τ κυττάρων περιφερικού αίματος μειώνει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων. Αυτή η καταστολή εξαρτάται από την δόση του VEGF όσο και από την χρονική διάρκεια της καλλιέργειας. Ωστόσο είναι όμοια τόσο στα δείγματα από ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών όσο και από φυσιολογικές δότριες. Τα CD3+ Τ κύτταρα μετά την ενεργοποίηση τους εκφράζουν τον VEGFR-2 κάτι που επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής, ανοσοϊστοχημεία και Western Blot ανάλυση. Ενώ η κατασταλτική δράση του VEGF στα Τ κύτταρα ασκείται άμεσα μέσω του VEGFR-2 καθώς η προσθήκη του αντιγόνου αδρανοποίησης anti-VEGFR-2 ανέστειλε την δράση αυτή τόσο στα δείγματα από ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών όσο και από φυσιολογικές δότριες. Επίσης, δείχθηκε πως ο VEGF μειώνει την κυτταροτοξική δραστηριότητα των Τ κυττάρων απέναντι σε κύτταρα στόχους από μια K562 κυτταρική σειρά και από μια κυτταρική σειρά Daudi καθώς και ότι τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα εκκρίνουν VEGF στο περιβάλλον της καλλιέργειας. Συνοψίζοντας η μελέτη απέδειξε πως τα Τ κύτταρα εκκρίνουν VEGF και εκφράζουν τον VEGFR-2 μετά την ενεργοποίηση τους και ο VEGF καταστέλλει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων μέσω του VEGFR-2.Αυτή η δημοσίευση πιστεύουμε πως παρείχε στην επιστημονική κοινότητα χρήσιμες πληροφορίες όσον αφορά τους μηχανισμούς καταστολής των Τ κυττάρων σ’ ένα περιβάλλον υπερβολικής παραγωγής αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου όπως σε συνθήκες ανάπτυξης κακοήθειας. Δείξαμε πως η καταστολή ασκείται μέσω της έκφραση του VEGFR-2 στην κυτταρική επιφάνεια των Τ κυττάρων. Συνεπώς, ο VEGF εκτός από ένας σημαντικός παράγοντας για την αγγειογέννεση φαίνεται να έχει κατασταλτική δράση στα Τ-κύτταρα και πιο συγκεκριμένα στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που εμπλέκονται στην καταπολέμηση του καρκίνου . Eίναι γνωστό ότι η παραγωγή μικρής ποσότητας του VEGF από τα Τ κύτταρα, συμβάλει στην τοπική αγγειογέννεση κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν την πολλαπλή δράση του VEGF στην καρκινογέννεση και στην πρόοδο της νόσου και ενδυναμώνει τον προγνωστικό του ρόλο στον καρκίνο των ωοθηκών. Ενώ υπάρχει και κλινική συσχέτιση μετά από από πρόσφατες αναφορές που προτείνουν πως υπάρχει όφελος από την προσθήκη ενός μονοκλωνικού αντισώματος anti-VEGF στα πρωτόκολλα χημειοθεραπείας σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο ωοθηκών. Τα αποτελέσματα που αφορούν την επίδραση του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου στους υποπληθυσμούς των λεμφοκυττάρων από δείγματα ασκιτικού υγρού ασθενών με καρκίνο ωοθηκών δημοσιεύθηκαν το Νοέμβριο του 2012 στο περιοδικό British Journal of Cancer. Εν συντομία, δείχθηκε πως η προσθήκη του VEGF στις καλλιέργειες των Τ κυττάρων που απομονώθηκαν από ασκιτικό υγρό ασθενών με καρκίνο ωοθηκών μειώνει σημαντικά τον αριθμό και τον βαθμό πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων. Αυτή η καταστολή εξαρτάται από την δόση του VEGF όσο και από την χρονική διάρκεια της καλλιέργειας. Τα CD3+ Τ κύτταρα μετά την ενεργοποίηση τους εκφράζουν τον VEGFR-2 κάτι που επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής, ανοσοϊστοχημεία και Western Blot ανάλυση. Ενώ η κατασταλτική δράση του VEGF στα Τ κύτταρα ασκείται άμεσα μέσω του VEGFR-2 καθώς η προσθήκη του ειδικού αντιγόνου αδρανοποίησης anti-VEGFR-2 ανέστειλε την δράση αυτή. Επίσης, δείχθηκε πως ο VEGF μειώνει την κυτταροτοξική δραστηριότητα των Τ κυττάρων απέναντι σε κύτταρα στόχους από μια K562 κυτταρική σειρά από μια κυτταρική σειρά Daudi καθώς και απέναντι σε αυτόλογα καρκινικά κύτταρα που απομονώθηκαν από το ασκιτικό υγρό των ασθενών αυτών. Επίσης δείχθηκε πως τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα εκκρίνουν VEGF στο περιβάλλον της καλλιέργειας. Συνοψίζοντας η μελέτη απέδειξε πως τα Τ κύτταρα που πρόερχονται από ασκίτη ασθενών με καρκίνο ωοθηκών εκκρίνουν VEGF και εκφράζουν τον VEGFR-2 μετά την ενεργοποίηση τους. Ο VEGF καταστέλλει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων μέσω του VEGFR-2.Αυτή η δημοσίευση επιβεβαίωσε τα ευρήματα της προηγούμενης ενώ παρείχε στην επιστημονική κοινότητα χρήσιμες νέες πληροφορίες όσον αφορά τους μηχανισμούς καταστολής των Τ κυττάρων καθώς μελετήθηκαν κύτταρα προερχόμενα από ένα περιβάλλον υπερβολικής παραγωγής VEGF όπως το ασκιτικό υγρό ασθενών με καρκίνο ωοθηκών. Είναι χαρακτηριστικό πως τα επίπεδα του VEGF που είναι απαραίτητα για να προκαλέσουν σημαντική καταστολή του πολλαπλασιασμού και της λειτουργικότητας των Τ κυττάρων ήταν όμοια με αυτά που μετρήθηκαν στον ασκίτη των ασθενών τόσο από αυτή τη μελέτη όσο και από προηγούμενες τύπου cohort μελέτες ασθενών με προχωρημένο καρκίνο ωοθηκών που πραγματοποιήθηκαν από την Θεραπευτική Κλινική του ΕΚΠΑ. Είναι επίσης σημαντικό να τονιστεί, ότι η δράση των Τ κυττάρων απέναντι στα αυτόλογα καρκινικά κύτταρα καθώς και η επίδραση του VEGF σ’ αυτή είναι το κύριο χαρακτηριστικό αυτής της μελέτης σε σχέση με τη προηγούμενη δημοσίευση της έρευνας μας. Συνοψίζοντας, αποδείξαμε για πρώτη φορά ότι Τ λεμφοκύτταρα από ασκιτκό υγρό ασθενών με καρκίνο ωοθηκών εκκρίνουν VEGF και εκφράζουν τον υποδοχέα VEGFR-2 στην επιφάνεια τους ως απάντηση στην ενεργοποίηση τους. Αυτά τα ευρήματα προτείνουν ότι η ενεργοποίηση των Τ κυττάρων από τον όγκο οδηγεί στην έκφραση του VEGFR-2, που με τη σειρά του επιφέρει την καταστολή των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων από τον VEGF που παράγεται από τον όγκο, ούτως ώστε να λάβει χώρα μια ανοσοκατασταλτική δράση. Αυτά τα ευρήματα ίσως έχουν κλινική συσχέτιση , ειδικά μετά από πρόσφατες μελέτες που προτείνουν πως υπάρχει όφελος από την προσθήκη του μονοκλωνικού αντισώματος αντι-VEGF, bevacizumab, στα πρωτόκολλα χημειοθεραπείας για την αντιμετώπιση του προχωρημένου καρκίνου ωοθηκών. Η λογική είναι ότι οι θεραπείες που στρέφονται κατά του VEGF ή και του VEGFR-2 ίσως στοχεύουν όχι μόνο την αγγειογέννεση αλλά επίσης και την διαφυγή του όγκου από την ανοσολογική επιτήρηση. Αν κάτι τέτοιο είναι αλήθεια, ο βαθμός επίδρασης του VEGF στο ανοσολογικό σύστημα ίσως μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να επιλεχθούν οι ασθενείς που πιθανόν να ωφεληθούν από τέτοιες προσεγγίσεις