Molecular characterization of Pseudomonas aeruginosa isolates deriving from aquatic environments of Greece

A large number of antibiotic-resistant P. aeruginosas isolates are continuously discharged into natural water basins mainly through sewage. However, the environmental reservoirs of antibiotic resistance factors are poorly understood. In this study, the antibiotic resistance patterns of 245 isolates from various aquatic sites in Greece were analyzed. Twenty-three isolates showing various multi-drug resistance in clinically relevant antibiotics such as cefotaxime, aztreonam, ceftazidime, cefepime and meropenem, were screened phenotypically and by molecular methods for the presence of extended spectrum β-lactamases (ESBLs), while 77 isolates with various resistant phenotypes were screened for the presence of class 1 and class 2 integrase genes. The aztreonam-resistant isolates and ESBL producers were the main resistant phenotypes in all habitats tested. In 13/77 isolates class 1 integron was detected, while all tested isolates were negative for the presence of the class 2 integrase gene. CTX-M group 9 β-lactamase was present in a small number of isolates (three isolates) highlighting the emergence of ESBL genes in aquatic environments. The latter results suggest the Greek water bodies as a potential reservoir of resistant P. aeruginosa isolates posing threats to human and animal health. The recently described Double Locus Sequence Typing (DLST) typing scheme implemented to deeply characterize the genetic profiles of 52 resistant environmental Pseudomonas aeruginosa isolates derived from aquatic habitats of Greece. DLST scheme was able not only to assign an already known allelic profile to the majority of the isolates but also to recognize two new ones (ms217-190, ms217-191) with high discriminatory power. A third locus (oprD) was also used for the molecular typing, which found to be fundamental for the phylogenetic analysis of environmental isolates given the resulted increased discrimination between the isolates. Additionally, the circulation of acquired resistant mechanisms in the aquatic habitats according to their genetic profiles was proved to be more extent. Hereby, we suggest that the combination of the DLST to oprD-typing can discriminate phenotypically and genetically related antibiotic resistant, environmental P. aeruginosa isolates providing reliable phylogenetic analysis at a loca level.Ένας μεγάλος αριθμός ανθεκτικών στελεχών του βακτηρίου P. aeruginosa εκχέονται συνεχώς στους φυσικούς υδάτινους αποδέκτες, κυρίως μέσω των λυμάτων. Ωστόσο, οι παράγοντες που επηρεάζουν την αντοχή στις περιβαλλοντικές δεξαμενές είναι ακόμα ελάχιστα μελετημένοι. Στη παρούσα μελέτη, αναλύθηκε το προφίλ μικροβιακής αντοχής σε αντιβιοτικά κλινικής σημασίας, 245 στελεχών απομονωμένων από ποικίλα υδάτινα περιβάλλοντα του ελλαδικού χώρου. Από αυτά 23 στελέχη που εμφάνισαν προφίλ πολύ-ανθεκτικότητας σε σημαντικά αντιβιοτικά, όπως στην κεφοταξίμη, στην αζτρεονάμη, στην κεφταζιδίμη, στην κεφεπίμη και στην μεροπενέμη, υποβλήθηκαν σε φαινοτυπικές και μοριακές διαδικασίες για την ανίχνευση ευρέους φάσματος β-λακταμασών (Extended Spectrum b-Lactamases: ESBLs), ενώ επιπλέον, 77 στελέχη με ποικίλα προφίλ αντοχής ελέγχθηκαν για την παρουσία των γονιδίων που κωδικοποιούν την ιντεγκράση τάξης 1 και τάξης 2. Τα στελέχη με φαινότυπο αντοχής R1 με χαρακτηριστική αντοχή στο αντιβιοτικό αζτρεονάμη και τα στελέχη με φαινότυπο ESBL, ήταν οι κύριοι φαινότυποι αντοχής στα υπό εξέταση περιβαλλοντικά ενδιαιτήματα. Σε 13/77 στελέχη ανιχνεύθηκαν επιτυχώς γονίδια της ιντεγκράσης τάξης 1, ενώ τα στελέχη ήταν αρνητικά για την παρουσία του γονιδίου της ιντεγκράσης τάξης 2. Σε τρία στελέχη ανιχνεύθηκε το γονίδιο που κωδικοποιεί μια κεφοταξιμάση, την CTX-M ομάδα 9 β-λακταμάση, τονίζοντας έτσι την εμφάνιση γονιδίων ESBL στα υδάτινα περιβάλλοντα. Τα τελευταία αποτελέσματα υποδεικνύουν τα ελληνικά υδάτινα οικοσυστήματα ως πιθανή δεξαμενή ανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa, τα οποία αποτελούν απειλή για την υγεία τόσο των ανθρώπων όσο και των ζώων. Το τυποποιητικό σχήμα Double Locus Sequence Typing (DLST), το οποίο δημοσιεύτηκε πρόσφατα, εφαρμόστηκε για τον γενετικό χαρακτηρισμό 52 περιβαλλοντικών στελεχών P. aeruginosa με ποικίλο και σημαντικό προφίλ αντοχής. Η μέθοδος αποδείχτηκε ικανή όχι μόνο να προσδώσει στα στελέχη ένα ήδη γνωστό γονοτυπικό προφίλ (allele profile) αλλά και να αναγνωρίσει δύο νέα αλληλόμορφα (ms217-190, ms217-191) με υψηλή διακριτική ικανότητα. Ένας τρίτος γενετικός τόπος (oprD) χρησιμοποιήθηκε επιπλέον για την μοριακή τυποποίηση, ο οποίος αποδείχθηκε ουσιαστικός όταν πραγματοποιείται φυλογενετική ανάλυση περιβαλλοντικών στελεχών, καθώς παρατηρήθηκε αυξημένη διάκριση μεταξύ των γενετικά κοντινών στελεχών του βακτηρίου. Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι η εκτεταμένη διασπορά των επίκτητων μηχανισμών αντοχής στα διάφορα υδάτινα ενδιαιτήματα καθορίζεται σε έναν βαθμό από το γενετικό τους προφίλ. Ολοκληρώνοντας, προτείνουμε ότι με τον συνδυασμό του νέου τυποποιητικού σχήματος DLST σε συνδυασμό με την oprD-τυποποίηση είναι δυνατόν να διακριθούν φαινοτυπικά και γενετικά σχετιζόμενα περιβαλλοντικά στελέχη του P. aeruginosa παρέχοντας αξιόπιστη φυλογενετική ανάλυση σε τοπικό επίπεδο