In vitro and in vivo evaluation of the antimicrobial activity of carbapenems against VIM metallo-β-lactamase-producing Enterobacterial

OBJECTIVES: Evaluation of the antimicrobial activity of carbapenems against VIMmetallo-β-lactamase-producing Enterobactericeae, including Klebsiella pneumoniae isolates,using in vitro ( MIC, killing curves) and in vivo methodologies (murine thigh model).METHODS: Seven VIM-1 metallo-β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolatesexhibiting different levels of susceptibility to carbapenems were studied. Isolates wererecovered from blood cultures of patients treated in five Athens hospitals during the period2003-2005. Species identification was performed using the API20E system (BioMerieux).Isolates were typed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The presence of blaVIM-1 genewas confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and nucleotide sequencing. Antibioticsusceptibility status of the isolates to selected antimicrobials was assessed by (a) the Kirby-Bauer method, (b) determination of minimum inhibitory concentrations (MIC) using E-testand (c) determination of MICs and minimum bactericidal concentrations (MBCs) using amicrodilution method. In vitro time-kill assays were performed with different inocula (104,106 and 108 cfu/ml) using carbapenems (imipenem, meropenem and ertapenem) as well asother antimicrobial agents (aztreonam and gentamicin). A β-lactam-susceptible Klebsiellapneumoniae strain lacking any acquired bla gene and expressing only the species specificblaSHV-1 was used as a control. For the experimental murine thigh infection, animals that hadbeen rendered neutropenic after treatment with cyclophosphamide were used. Mice were infected with three VIM-1 positive isolates with representative carbapenem MICs (lowintermediate and high). The wild-type VIM-negative isolate was also utilized for controlpurposes. The carbapenems (imipenem and meropenem) were applied in two dosingregimens, 30 and 60 mg/kg q2h given by intaperitoneal injections (a total dose of 360 and 720mg/kg) respectively.RESULTS: All isolates exhibited resistance phenotypes compatible with production of VIMmetallo-β-lactamase. They expressed either resistance or reduced susceptibility tocarbapenems according to the CLSI 2010 criteria. In time-kill assays there was an enhancedmicrobial killing especially during the first hours, for the lowest inoculum and the highestcarbapenem concentration. An inversely proportional correlation between the MIC of theisolate and the rate as well as the duration of killing in the presence of a carbapenem wasevident. Nevertheless, the reduction rate of colony forming units (cfu) (viable cells) wasminimum for the highest inoculum (108 cfu/ml) with the susceptible control isolate. Complete microbial killing within 24 hours was observed for the low inoculum (104 fu/ml) for allisolates and the intermediate inoculum (106 cfu/ml) for the susceptible control isolate and thehighest carbapenem concentrations. Α logarithmic reduction of the initial inoculum inverselyproportional to the MIC of the isolate was seen; however, bacterial regrowth was evident at24 hours. A strong inoculum effect was observed with both carbapenems. In the murine thighinfection model the antimicrobial efficacy of carbapenems was high against the VIM-negativecontrol isolate, intermediate against the VIM-positive isolate with the lower MIC and low onthe VIM-positive isolate with the higher carbapenem MICs. Both treatment regimensachieved drug plasma levels above the MIC (T > MIC) 33 - 45% with favourable bactericidalactivity for isolates with MIC ≤ 4 μg/ml. The therapeutic regimen with the higher carbapenemdosage displayed greater bactericidal activity for all isolates. Μeropenem exhibited in vivosuperior antibacterial activity than imipenem against isolate with the same MIC to the drug.CONCLUSION: Based on accumulated clinical experience, it has been proposed thatcarbapenems may be selectively used in serious hospital infections such as bacteremias,caused by carbapenemase-producing enterobacteria. Results of the present animalexperimental study provide further support to the hypothesis that the drugs of this class(preferentially meropenem) may have a place in the treatment of these life- threatening infections.ΣΚΟΠΟΣ: Mελέτη της αντιμικροβιακής δράσεως των καρβαπενεμών έναντιεντεροβακτηριακών περιλαμβανομένων στελεχών Klebsiella pneumoniae που παράγουνμεταλλο-β-λακταμάσες της ομάδας VIM με τη χρήση in vitro (MIC, καμπύλες θανάτωσης)καθώς και in vivo (πειραματικές λοιμώξεις σε επίμυες) μεθοδολογιών.ΜΕΘΟΛΟΓΙΑ: Μελετήθηκαν επτά στελέχη Klebsiella pneumoniae με διαφορετικήευαισθησία στις καρβαπενέμες, τα οποία παρήγαγαν VIM-1 μεταλλο-β-λακταμάση. Ταστελέχη απομονώθηκαν από καλλιέργειες αίματος ασθενών από πέντε ελληνικά νοσοκομείακατά την περίοδο 2003-2005. Η ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με το σύστημα API20E(BioMerieux). H τυποποίηση των στελεχών Κ. pneumoniae έγινε με ηλεκτροφόρησηπαλλόμενου πεδίου (PFGE). Η παρουσία του blaVIM γονιδίου, πιστοποιήθηκε με δοκιμασίααλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Ο έλεγχος ευαισθησίας των υπό μελέτηστελεχών στα αντιβιοτικά έγινε: (α) με αντιβιογράμματα κατά Kirby-Bauer (β) μεπροσδιορισμό των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων (MIC) των αντιβιοτικών με τημέθοδο E-test (γ) με προσδιορισμό των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων (MIC) καιτων ελάχιστων βακτηριοκτόνων συγκεντρώσεων (MBC) με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων.Ακολούθησε in vitro μελέτη της κινητικής θανάτωσης των επτά στελεχών (killing curves) σεδιαφορετικά ενοφθαλμίσματα (104, 106 και 108 cfu/ml ) υπό την επίδραση καρβαπενεμών(ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη) καθώς και άλλων αντιμικροβιακών παραγόντων(αζτρεονάμη και γενταμικίνη). Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ευαίσθητο στέλεχος K.pneumoniae που δεν περιείχε το blaVIM γονίδιο , αλλά το ειδικό για το είδος γονίδιο blaSHV-1που αδρανοποιεί την αμπικιλλίνη. Στη συνέχεια επιλέγησαν τρία αντιπροσωπευτικά -όσοναφορά τις ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις MIC- VIM-θετικά στελέχη καθώς και τοαρνητικό στέλεχος-μάρτυρας προκειμένου να μελέτηθεί in vivo η αλληλεπίδρασή τους με τιςευρέως χρησιμοποιούμενες καρβαπενέμες ιμιπενέμη και μεροπενέμη, με βάση το μοντέλοτης εντοπισμένης λοίμωξης στο μηρό ουδετεροπενικών μύων, για δύο δοσολογικά σχήματα,30 και 60 mg/kg σωματικού βάρους, με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση, ανά 2 ώρες έωςσυμπληρώσεως 24ώρου, αντίστοιχα.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Όλα τα στελέχη παρουσίαζαν αντοχή ή μειωμένη ευαισθησία στηνιμιπενέμη σύμφωνα με τα κριτήρια CLSI 2010 και είχαν φαινοτυπικά χαρακτηριστικάσυμβατά με παραγωγή β-λακταμασών τύπου VIM. Το εύρος των MIC για τις καρβαπενέμεςαντιπροσώπευε ικανοποιητικά το φάσμα των VIM-θετικών στελεχών που απομονώνονταιστα ελληνικά νοσοκομεία. Στη μελέτη της κινητικής θανάτωσης διαπιστώθηκε αυξημένημικροβιακή θανάτωση ιδιαίτερα τις πρώτες ώρες, για το χαμηλότερο ενοφθάλμισμα και τηνυψηλότερη συγκέντρωση καρβαπενέμης. Παράλληλα, παρατηρήθηκε η αντιστρόφως ανάλογη σχέση των τιμών MIC με το ρυθμό και τη διάρκεια θανάτωσης παρουσίακαρβαπενέμης. Ωστόσο, στο πυκνότερο μικροβιακό ενοφθάλμισμα (108 cfu/ml), ηανταπόκριση υπήρξε ελάχιστη, ακόμα και για το ευαίσθητο VIM αρνητικό στέλεχος. Μόνογια το χαμηλότερο ενοφθάλμισμα 104 cfu/ml σε όλα τα στελέχη και στο ενδιάμεσοενοφθάλμισμα 106 cfu/ml στο ευαίσθητο στέλεχος και για την υψηλότερη συγκέντρωσηιμιπενέμης, επιτεύχθηκε πλήρης θανάτωση του μικροβίου στις 24 ώρες. Στις υπόλοιπεςπεριπτώσεις υπήρξε ανάκαμψη στις 24 ώρες με προηγούμενη λογαριθμική μείωση τωναρχικών αποικιών αντιστρόφως ανάλογη της MIC του μικροβιακού στελέχους. Σε κάθεπερίπτωση επιβεβαιώθηκε σημαντικό φαινόμενο ενοφθαλμίσματος το οποίο έχει περιγραφείμε πενικιλλίνες, όχι όμως με αμινογλυκοσίδες, κινολόνες και ιμιπενέμη. Ομοίως, στηνπειραματική λοίμωξη σε μύες επιβεβαιώθηκε ότι η βακτηριοκτόνος δράση τωνκαρβαπενεμών ήταν μεγίστη στο VIM αρνητικό στέλεχος, ενδιάμεση στο VIM θετικόστέλεχος με τη χαμηλότερη MIC και μικρότερη στο VIM θετικό στέλεχος με την υψηλότερηMIC. Η επίτευξη Τ > MIC για χρόνο 33- 45 % του μεσοδιαστήματος των δόσεων,συνοδεύτηκε από ικανοποιητικό θεραπευτικό αποτέλεσμα για τα στελέχη με χαμηλή καιενδιάμεση MIC (2 και 4 μg/ml). Το θεραπευτικό σχήμα με την υψηλότερη δόσηκαρβαπενεμών ήταν αποτελεσματικότερο για όλα τα στελέχη. In vivo, η μεροπενέμη ήταν σημαντικά δραστικότερη της ιμιπενέμης (μετρήσιμη αντιμικροβιακή δράση) για VIM-θετικόστέλεχος με την ίδια MIC.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης είναι συμβατά με τηνπρόσφατα διατυπωθείσα θέση σύμφωνα με την οποία οι καρβαπενέμες - και κυρίως ημεροπενέμη - μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη θεραπεία των νοσοκομειακών λοιμώξεωνπου προκαλούνται από VIM-θετικά στελέχη Klebsiella pneumoniae