Study of the biological activities of novel metallic complexes of vanadium, with cytotoxic properties

In the present Doctoral Thesis the vanadium-complexes Pyrivan: {(pyH)6[VV10O28].2H2O} (1),Nicotivan: {(LH)4[VV10O26(OH)2].2L.2H2O} (2), Pipervan: {(L’H2)[(VO3)]2}n (3), Cadivan:{(L’’H2)3[VIV9VV6O36].14H2O} (4) and Azivan: {[VIV11VV7Na10O44(N3)(H2O)32].H2O}n (5), where L=Nicotinamide, py= Pyridine, L’= Butane-1,4-diamine and L’’= Pentane-1,5-diamine, where preparedby using NH4VO3 (for 1, 2 and 3) and VOSO4.4H2O (for 4 and 5), as starting materials, in varioussynthetic procedures. The putrescinic dication=L’H22+, that is present in 3 was formed in situ via ametal-assisted, complicated redox process, that involved the originally used piperazine, as areactant. The molecular and crystal structures of the complexes were determined by single-crystal,X-ray crystallography. Compounds 1, 2 and 4 contain discrete, homo- (1, 2) and hetero-valent (4)polyoxometalate anions, whereas complexes 3 and 5 have polymeric structures. The complexeswere characterized by IR, NMR and EPR spectra, by thermal decomposition techniques and byroom-temperature magnetic susceptibilities. All the data are discussed in terms of the compositionand known structures of the complexes. The VIV…VIV exchange interactions in cluster 4 are ofantiferromagnetic nature. In the present study five novel polyvanadate, with Nicotinamide, Pyridine,Piperazine, Cadaverine and Azides, as ligands were studied. The complexes named as: Nicotivan(1), Pyrivan (2), Pipervan (3), Cadivan (4) and Azivan (5) were synthesized and fully identified, andthese complexes are submitted bio-medical experimental examinations, in order to qualify theirantitumor , cytotoxic and antiplatelet actions on LMS malignamnt cells and human platelets.These complexes presented cytotoxic action in malignant LMS cells, but not any significant activity against fibroblasts. The IC50 in the LMS was: Cadivan (1,2250,238 κM) > Azivan (2,8 κM, LMScells) > Nicotivan (4,767 ± 0,525 κM) > Pyrivan (10,60,883 κM) > Pipervan (15,9 0,455 κM). InMCF-7 the IC50 were: Pyrivan (16,7 ± 0,23) > Pipervan (16,23 ± 0,74) > Nicotivan (6,93 ± 0,12) >Azivan (3,4 ± 0,37) > Cadivan (2.36 ± 0,37). In physiologic fibroblasts and in the MRC-5 line theIC50values of the novel complexes present activities, following the order: Pipervan (34,23 ± 1,35) >Azivan (12,93 ± 1,33) > Cadivan (2,43 ± 0,13) > Pyrivan (12,3 ± 0,21) > Nicotivan (9,83 ± 0,34). TheIC50 values of the five ligands present the following order: Piperazine (126,6 ±1,6) > Pyridine(107,6mM ±3,2) > Nicotinamide (47,4 mM ±1,3) > Cadaverine (10,8 mM ±0,4> Sodium Azide (2,3mM±0,7). In flow cytometry of LMS cells of Wistar rats all the complexes showed apoptotic phenomena.. In the apoptosis the activity of the complexes follows the order: Azivan (60,16%) > Pipervan >(57,97%) > Cadivan (53,76%) > Nicotivan (46,33%) > Pyrivan (43,75%), in comparison with theControl value, (3,22%).They also inhibit the human platelet aggregation, in the human plasma (exvivo),as follows:Nicotivan : The IC50 for PAF ranges between 1κM to 2κM, while for arachidonicacid (ARA) between 2 and 4 κM. The IC50, at which Nicotivan inhibits the action of ADP, rangesbetween 20 and 30 κM. Azivan : The IC50 for PAF ranges between 1κM - 2κM, while forarachidonic acid between 4 κM and 6 κM and for ADP between 4 and 10 κM. Pyrivan : The IC50 forPAF, ranges between 20 - 40 κM, while for arachidonic acid between 20 - 40 κM. Also the IC50 forADP ranges between 80 - 120 κM. Pipervan : The IC50 for PAF ranges between 20 κM and 40 κM,while for arachidonic acid between 20 κM - 40 κM. Also the IC50 value for ADP ranges between 200κM and 300 κM. Cadivan : The IC50 value for PAF ranges between 2 κM and 6 κM, while forarachidonic acid between 2 κM and 2,5 κM. Also the IC50 value for ADP ranges between 20 κM and40 κM. The organic ligands of these vanadium complexes, exhibited antiplatelet effects but thepresence of vanadium appears to promote the antiplatelet activity of these complexes. Consequentlythe studied vanadium complexes present significant cytotoxic properties, as well as inhibition ofplatelet aggregation.Το σύστημα αντίδρασης NH4VO3/νικοτιναμίδιο (L) σε H2O έδωσε το πορτοκαλί στερεό(LH)4[VV10O26(OH)2].2L.2H2O (Nicotivan, 1). Η υδρόλυση των ιόντων NH4+ και ηπαρατεταμένη θέρμανση του υδατικού διαλύματος της αντίδρασης δημιουργούν τοκατάλληλο pH για το σχηματισμό του ανιόντος [VV10O26(OH)2]4-. Η πρωτονίωση τωντεσσάρων μορίων L λαμβάνει χώρα στο πυριδινικό άτομο N, που είναι το πιο βασικό. Ηδομή του ανιόντος αποτελείται από δέκα οκταεδρικές μονάδες {VVO6}, που έχουν κοινέςακμές. Το ανιόν έχει δύο μ6-Ο2-, δύο μ3-Ο2-, δύο μ3-ΟΗ-, δεκατέσσερα μ2-Ο2- και 8τερματικά Ο2-. Οι γεωμετρίες ένταξης των δέκα ιόντων VV είναι παραμορφωμένεςοκταεδρικές. Η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου σταθεροποιείται από δεσμούς Η και απόπ-π αλληλεπιδράσεις, μεταξύ των αρωματικών δακτυλίων.Το τελικό υπόλειμμα της θερμικής διάσπασης του 1 είναι V2O5. Το 1H NMR φάσμα σεDMSO-d6 αποκαλύπτει την αποπρωτονίωση του ιόντος [VV10O26(OH)2]4- και το σχηματισμότου ιόντος [V10O28]6-.Η αντίδραση του NH4VO3 με πυριδίνη (py) σε Η2Ο, υπό θέρμανση, οδήγησε στηναπομόνωση πορτοκαλί στερεού, με τύπο (pyH)6[V10O28].2H2O (Pyrivan, 2), σε απόδοση40%. Η στοιχειομετρία, η διαμαγνητική φύση και τα μήκη δεσμού V-O αποδεικνύουν ότιόλα τα μεταλλικά κέντρα βρίσκονται στην οξειδωτική βαθμίδα +5. Η δομή του ανιόντοςαποτελείται από δέκα οκταεδρικές μονάδες {VVO6}, που έχουν κοινές ακμές.Αυτές οι μονάδες περιλαμβάνουν δύο μ6-Ο2-, τέσσερα μ3-Ο2-, δεκατέσσερα μ2-Ο2- και οκτώτερματικούς όξο- υποκαταστάτες. Υπάρχουν πέντε τύποι κρυσταλλογραφικώς ανεξάρ-τητων δεσμών Η, που σταθεροποιούν την κρυσταλλική δομή του συμπλόκου,σχηματίζοντας ένα 2D δίκτυο.Η ταινία στα 3138 cm-1 στο IR φάσμα οφείλεται στη δόνηση τάσεως του δεσμού N+-H,του ιόντος pyH+. Το 13C NMR φάσμα του 2 σε DMSO-d6 είναι απλό και αποτελείται απότρία σήματα, των τριών χημικά ανισοδύναμων ατόμων άνθρακα του pyH+. Το τελικόυπόλειμμα της θερμικής διάσπασης του συμπλόκου είναι V2O5.Το σύστημα αντίδρασης NH4VO3/πιπεραζίνη (pipz) σε CH3COOH 1Μ στους 80 ºC έδωσεπορτοκαλί κρυστάλλους του ιοντικού πολυμερούς {(L’H2)[(VO3)]2}n (Pipervan, 3), όπουL’H2 είναι το δικατιόν του 1,2-Διαμινοβουτανίου. Η μετατροπή της pipz σε 1,2-διαμινοβουτάνιο προέρχεται από μια πολύπλοκη αντίδραση οξειδοαναγωγής, κατά τηνοποία τρία μόρια pipz ανάγονται προς L’ (που στη συνέχεια πρωτονιώνεται διπλά), ενώ τοτέταρτο μόριο οξειδώνεται προς πυραζίνη, που παραμένει στο διάλυμα. Η δομή τουσυμπλόκου περιέχει ανιοντικές αλυσίδες {[VO3]-}n, με την καθεμιά να αποτελείται απόάπειρο αριθμό τετραέδρων {VVO4}, που το καθένα έχει δύο κοινές κορυφές με τα δύογειτονικά του.Το περιβάλλον ένταξης γύρω από το VV είναι τετραεδρικό, και η απόσταση μεταξύ δύογειτονικών μεταλλικών κέντρων είναι 3.417 Å. Η κρυσταλλική δομή του 3 σταθεροποιείταιαπό δεσμούς -Η. Στο IR φάσμα του συμπλόκου, οι ισχυρές ταινίες στα 927 και 913 cm-1αποδίδονται σε δονήσεις τάσεως, των τερματικών δεσμών VV=O. Η παρατεταμένη θέρμανση του θειικού άλατος του δικατιόντος του 1,5-διαμινοπεντανίου(L’’), VOSO4.4H2O και NaOH σε H2O στους 80 ºC έδωσε πολύ σκούρους πράσινουςκρυστάλλους της ένωσης (L’’H2)3[VIV9VV6O36].14H2O (Cadivan, 4) με απόδοση 30-40%. Οιοξειδωτικές βαθμίδες των κέντρων V υπολογίσθηκαν με βάση τη μέθοδο BVS. Η ίδιαανάλυση έδειξε, ότι όλα τα άτομα Ο του δεκαπεντεβαναδικού ανιόντος είναι O2-. Το ιόν[V15O36]6- έχει σχήμα σφαίρας, με τα δεκαπέντε μεταλλικά κέντρα να βρίσκονται στηνεπιφάνεια της σφαίρας. Κάθε ιόν V είναι 5-ενταγμένο και σχηματίζει δεσμούς με ένατερματικό όξο- υποκαταστάτη και τέσσερα γεφυρωτικά (μ2-, μ3-) ιόντα οξειδίου.Η γεωμετρία ένταξης των ιόντων V είναι τετραγωνική πυραμιδική. Ο πλήρης δομικόςπυρήνας του ανιόντος είναι {VIV9VV6O15(μ2-Ο)3(μ3-Ο)18}6-. Παρά την παρουσίαπαραμαγνητικών κέντρων VIV και τη συνεπακόλουθη παραμαγνητική φύση του 4, το 1HNMR φάσμα του σε DMSO-d6 παρουσιάζει οξέα σήματα, που οφείλονται στα πρωτόνια,που είναι συνδεδεμένα με τα άτομα C του L’’H22+. Το EPR φάσμα σε σκόνη του συμπλόκουστους 77 Κ είναι χαρακτηριστικό ιόντων [V15O36]n-, μικτού σθένους.Η τιμή της ενεργού μαγνητικής ροπής του συμπλόκου στους 300 Κ (4.30 B.M.)υποδηλώνει σημαντικές αντισιδηρομαγνητικές αλληλεπιδράσεις ανταλλαγής. Το τελικόυπόλειμμα της θερμικής διάσπασης του συμπλόκου είναι V2O5. Το σύστημα αντίδρασηςVOSO4.4H2O/H2O/NaN3/NaOH σε H2O υπό θέρμανση οδήγησε σε χακί-σκούρους πράσινουςκρυστάλλους του 3D πολυμερούς συμπλόκου {[VIV11VV7Na10O44(N3)(H2O)32].H2O}n(Azivan, 5) με απόδοση 35-40%. Η δομή του συμπλόκου αποτελείται από ανιόντα[VIV11VV7O44(N3)]10-, 1D κατιοντικές αλυσίδες με επαναλαμβανόμενη δομική μονάδα την{Na10(H2O)32}10+ και πλεγματικά μόρια H2O.Τα ανιόντα συνδέονται με τις κατιοντικές αλυσίδες σχηματίζοντας ένα 3D πολυμερέςδίκτυο. Οι θέσεις σύνδεσης των ανιόντων με τις κατιοντικές αλυσίδες είναι τερματικοί όξο-υποκαταστάτες του πολυοξοβαναδικού ανιόντος. Το βαναδικό ανιόν έχει σφαιρική δομή καιεγκλωβίζει ένα ιόν αζιδίου, που δεν σχηματίζει χημικούς δεσμούς με τα κέντρα V. Κάθεανιόν είναι το άθροισμα δεκαπέντε τετραγωνικών πυραμίδων {VO5}, που μοιράζονταικοινές ακμές και κορυφές. Από τους 44 όξο- υποκαταστάτες, οι δεκαοκτώ είναι τερματικοί,οι έξι μ2 και οι υπόλοιποι μ3. Τα ιόντα NaI είναι 6- και 5-ενταγμένα, με τους ύδατο-υποκαταστάτες να είναι τερματικοί και γεφυρωτικοί. Στο IR φάσμα του 5, οι ισχυρέςταινίες στα 962 και 940 cm-1 οφείλονται στις δονήσεις τάσεως των τερματικών δεσμώνVV=O και VIV=O, αντίστοιχα.Στις βιολογικές δράσεις τα πέντε σύμπλοκα του Βαναδίου που συνθέσαμε (Nikotivan,Azivan, Pyrivan, Pipervan, Cadivan) εμφανίζουν κάποιες δομικές αναλογίες όπως π.χ μιαανιονική πολυοξοβαναδική δομή του τύπου [VxOyOHz]n-, η οποία φαίνεται να είναιαποφασιστικής σημασίας για τις βιολογικές λειτουργίες, των εν λόγω συμπλόκων. Στηνδιδακτορική μας διατριβή μελετήσαμε μερικές θεμελιώδεις βιολογικές δράσεις των πέντεσυμπλόκων και συγκεκριμένα. Τις κυτταροτοξικές ιδιότητες σε τρείς διαφορετικούς τύπουςκυττάρων, δηλαδή στα νεοπλασματικά κύτταρα λειομυοσαρκώματος επίμυος Wistar, στανεοπλασματικά κύτταρα MCF – 7 καρκίνου του μαστού του ανθρώπου, καθώς και στα κύτταρα τύπου φυσιολογικού εμβρυονικού ινοβλάστη του ποντικού. Τον μηχανισμόθανάτωσης, εκ μέρους των πέντε συμπλόκων χωριστά, των νεοπλασματικώνλειομυοσαρκωματικών κυττάρων τύπου LMS, όπως αυτός αναδεικνύεται από τηνενσωμάτωση της φθορίζουσας ανεξίνης, όταν έχει ενεργοποιηθεί η απόπτωση, με τηνμέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Επίσης μελετήσαμε τις δράσεις των πέντε συμπλόκωνξεχωριστά στην συσσωρευτική λειτουργία των αιμοπεταλίων του ανθρώπου ex vivo,ενεργοποιώντας τα αιμοπετάλια μέσω των τριών διακεκριμένων οδών συσσώρευσης, τηνοδό του ADP, την οδό του PAF και την οδό του αραχιδονικού οξέος.Ανεξάρτητα από τα σύμπλοκα μελετήθηκαν και οι κυτταροτοξικότητα των πέντευποκαταστατών, όπως επίσης και οι αντίστοιχες δράσεις αυτών στην λειτουργία τηςαιμοπεταλιακής συσσώρευσηςΤα σύμπλοκα που χρησιμοποιήθηκαν εμφάνισαν κυτταροτοξικές δράσεις σε κακοήθηκυτταρα LMS, ενώ στους φυσιολογικούς ινοβλάστες δεν εμφάνισαν αξιόλογη δράση. Κατάσειρα το IC50 στα κακοήθη κυτταρα ήταν Cadivan (1,2250,238 μM) > Azivan (2,8 μM,LMS cells) > Nicotivan (4,767 ± 0,525 μM) > Pyrivan (10,60,883 μM) > Pipervan(15,90,455 μM). Στην σειρα MCF-7 οι τιμες IC50 στα σύμπλοκα είναι κατά σειρα Pyrivan(16,7 ± 0,23) > Pipervan (16,23 ± 0,74) > Nicotivan (6,93 ± 0,12) > Azivan (3,4 ± 0,37)> Cadivan (2.36 ± 0,37). Στους φυσιολογικους ινοβλάστες και την σειρα MRC-5 οι τιμεςIC50 στα σύμπλοκα εμφανίζουν την παρακάτω σειρά: Pipervan (34,23 ± 1,35) > Azivan(12,93 ± 1,33) > Cadivan (2,43 ± 0,13) > Pyrivan (12,3 ± 0,21) > Nicotivan (9,83 ±0,34).Στους υποκαταστάτες οι τιμές IC50 εχουν την παρακάτω σειρά: Πιπεραζίνη (126,6 ±1,6) >Πυριδίνη (107,6μΜ ±3,2) > Νικοτιναμίδιο (47,4 μΜ ±1,3) > Κανταβερίνη (10,8 μΜ ±0,4 >Αζίδιο του Νατρίου (2,3μΜ ±0,7).Στα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής στα κύτταρα LMS του επιμύος Wistar oέλεγχος των λειομυοσαρκωματικών κυττάρων LMS του επίμυος Wistar με την μέθοδο τηςκυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η χορήγηση των πέντε διαφορετικών συμπλόκων τουΒαναδίου σε δόσεις ίσες προς την IC50 εκάστου συμπλόκου έχουν ως αποτέλεσμα τουψηλό ποσοστό θανάτων μέσω αποπτωτικών φαινομένων. Όπως είδαμε όλα τα σύπλοκαεμφανίζουν δράση με πιο ισχυρή όσον αφορά το σύνολο των αποπτικών φαινομένων.Στο σύνολο των αποπτωτικών φαινομένων η σείρα είναι Azivan (60,16%) > Pipervan >(57,97%) > Cadivan (53,76%) > Nicotivan (46,33%) > Pyrivan (43,75%) και το Control(3,22%).Στα αποτελέσματα δράσεων των συμπλόκων του βαναδίου στην συσσώρευση τωναιμοπεταλίων του ανθρώπου Ex Vivo όλα τα σύμπλοκα του Βαναδίου, που συνθέσαμε στοπλαίσιο της παρούσας διατριβής αναστέλλουν την συσσώρευση των αιμοπεταλίων τουανθρώπου στο φυσιολογικό τους αιματικό πλάσμα (Ex Vivo), σε αιμοπετάλια τα οποίαείχαν ανοιχτές και τις τρείς φυσιολογικές οδούς συσσώρευσης. Συγκεκριμένα είχαμε ταεξής : Στο σύμπλοκο του Nicotivan: H τιμή IC50 του συμπλόκου κυμαίνεται για τον PAFμεταξύ 1 μM έως 2 μM, ενώ για το αραχιδονικό οξύ (ARA) μεταξύ 2 και 4 μM. Η τιμή IC50του Νικοτιβάν που αναστέλλει την δράση του ADP κυμαίνεται μεταξύ 20 και 30 μM.Στο σύμπλοκο του Azivan: Η τιμή IC50 κυμαίνεται για τον PAF μεταξύ 1μM – 2 μM, ενώγια το αραχιδονικό οξύ μεταξύ 4 μM έως 6 μM και για το ADP μεταξύ 4 και 10 μM.Στο σύμπλοκο του Pyrivan: Η τιμή IC50 για τον PAF κυμαίνεται μεταξύ 20 – 40 M, ενώγια το αραχιδονικό οξύ μεταξύ 20 – 40 μM. Επίσης η IC50 για το ADP κυμαίνεται μεταξύ 80– 120 μM.Στο σύμπλοκο του Pipervan: Η τιμή IC50 για τον PAF κυμαίνεται μεταξύ 20 μM και 40μM, ενώ για το αραχιδονικό οξύ μεταξύ 20 μM – 40 μM. Επίσης η IC50 για το ADPκυμαίνεται μεταξύ 200 μM και 300 μM.Στο σύμπλοκο του Cadivan: H IC50 για τον PAF κυμαίνεται μεταξύ 2 μM και 6 μM, ενώγια το αραχιδονικό οξύ μεταξύ 2 μM και 2,5 μM. Επίσης η IC50 για το ADP κυμαίνεταιμεταξύ 20 μM και 40 μM.Οι υποκαταστάτες των συμπλόκων, δηλαδή το νικοτιναμίδιο, το αζίδιο του νατρίου, ηπυριδίνη, η πιπεραζίνη και η κανταβερίνη εμφανίζουν επίσης ιδιότητες αναστολής τωναιμοπεταλίων και από τις τρείς οδούς, αλλά τελικά η παρουσία του βαναδίου φαίνεται ναενισχύει την αντιαιμοπεταλιακή δράση των συγκεκριμένων συμπλόκων ουσιών. Συνεπώς ηόλη μελέτη των εν λόγω συμπλόκων του στοιχείου Βαναδίου υποδεικνύει ότι αυτάεμφανίζουν σπουδαίες κυτταροτοξικές ιδιότητες, όπως επίσης και ιδιότητες αναστολής τωναιμοπεταλίων.Είναι πολύ σημαντικό η έρευνα επί της αιτιολογίας των εν λόγω ιδιοτήτων να εμβαθυνθείπεραιτέρω προκειμένω οι εν λόγω ουσίες να αποτελέσουν μια στερεή βάση ανάπτυξηςαντικαρκινικών φαρμάκων στοχευμένης κυτταροτοξικότητας, που να περιορίζεται μόνο στανεοπλασματικά κύτταρα και να αφήνει αλώβητα τα φυσιολογικά των ποικίλων ιστών τουοργανισμού. Αυτό φαίνεται να είναι κατ’ αρχάς εφικτό, αν θεωρήσουμε ότι η πλειονότητατων κακοήθων νεοπλασμάτων εμφανίζει κατά κύριο λόγο έναν ενεργειακό μεταβολισμόπεριορισμένου βεληνεκούς, εστιαζόμενο ουσιαστικά στην γλυκολυτική αλυσίδα, ενώ ημιτοχονδριακή λειτουργία είναι περιορισμένη. Είναι ενδεχόμενο οι ενώσεις του Βαναδίου ναλειτουργούν έτσι ώστε η γλυκόζη να μεταφέρεται κυρίως στο εσωτερικό τωνφυσιολογικών κυττάρων, ενώ να προκαλούν μια αυξημένη δυσχέρεια για την μεταφοράτους στο εσωτερικό των κακοήθων κυττάρων. Αν το φαινόμενο αυτό μπορεί να γενικευτείτότε μπορούμε να οδηγήσουμε τους περισσότερους γλυκολυτικούς κακοήθεις όγκους σεμαζικό θάνατο με σημαντικό βιολογικό κέρδος για έναν πάσχοντα οργανισμό