Bioconsolidation of porous stone substrates of historical monuments via biomineralization of calcium carbonate

This PhD Thesis presents the development of a bio-consolidation methodology for stone monument protection. Research in the field of monument protection has been intensified the last two decades due to the demand of more environmental and substrate friendly restoration procedures, the need of resolving the effects of the microbiological factor in stone decay and its potential for bio-restoration due to its proved ability to promote calcium carbonate precipitation. The basic prerequisites of such methodologies are that it should not pose a negative effect upon the stone, should be easily implemented, fiscally viable and detectable after application.The microorganisms presented were isolated from the ancient marble quarries of Pentelic marble and the Paiania cave in the outer district of Attiki, thus they are considered already adapted in the oligotrophic stone substrate. Sampling from the ancient quarry was performed during winter after rainfall in order to limit the sampling of microorganisms recently deposited via air transfer. Samples from the cave were collected during the same period taking advantage of the increase of percolating water from the cave ceiling that should activate the indigenous microflora. Isolation aimed for non-fastidious microorganisms, cultivable in a general growth medium. An holistic research approach could not be satisfied without a detailed bacterial identification. Therefore, genetic identification of the isolates has been re-developed aiming for the full or almost full 16S rDNA and not for a fragment as most published research in this field.A series of different nutrient sources was investigated to develop the appropriate growth medium that would promote adequate growth and circumvent precipitation that was observed when using the B4 medium. The growth curve for the microorganisms was performed in order to detect the point of maximal growth in the selected medium. Subsequently, the first screening for calcium carbonate formation on solid and liquid cultures provided important preliminary insight for the morphology of the bio-precipitate and when the process is completed. The initial tests included three different growth medium concentrations, analyzing the time of acetate exhaustion, calcium immobilization, the pH, the crystal morphology of calcium carbonate formed and the color of the crystals. Based on these parameters, the best candidates were selected for further investigation.Pentelic marble was selected as the test substrate because it has been the construction material of choice for some of the most renowned ancient monuments in Greece (e.g. the Parthenon). Monuments and statues from ancient Athens and other locations such as Delphi and Delos were constructed with Pentelic marble or marbles with similar physicochemical characteristics (Parian marble from Paros Island). Furthermore, it has not been tested for the colonization and biomineralization of microorganisms. One of the main characteristics is the low to negligible porosity. It is possible that this may be one of the factors why those monuments still stand in an open air environment. Low porosity provides a hostile environment for bacteria due to the fact that there are no sites for easy colonization. The only sites for early colonization will be presented to be the points of crystal fracture and change of crystal direction on the surface of the substrates.Cupriavidus metallidurans ACA-DC 4073 and Bacillus pumilus ACA-DC 4061 were the bacteria selected considering quantitative parameters like the weight increase accomplished and qualitative parameters such as the non-color transfer on the new crystals from the growth solution and viability after nutrient exhaustion. A statistical model was applied in order to investigate its applicability for determining the optimal values of selected factors for biomineralization: growth medium concentration, inoculum concentration and incubation temperature. The model assisted in performing simultaneous experiments identifying the conditions under which each isolate could accomplish the maximum bio-precipitation of calcium carbonate. The optimum conditions were reviewed for their accuracy in a final experimental session. All samples from the final test were subjected in sonication treatment in order to check the coherence of the new material. Finally the bacteria were applied on a larger marble surface area by spraying under non-sterile conditions. This test was regarded as a preliminary in situ approach. The only parameter controlled was the incubation temperature.Both selected isolates proved efficient in both liquid cultures and spraying application. Samples isolated from the first presented a considerable weight increase and the newly formed surface was resistant in sonication treatment. One of the main discoveries was the constant formation of vaterite from most bacteria when inoculated in the developed growth medium. Vaterite is considered as the least stable anhydrous calcium carbonate polymorph with calcite being the most stable one. Microbial involvement in precipitation procedure showed that it could stabilize vaterite. Samples analyzed with FT-IR after a few years did not show any difference. Furthermore, sonication did not alter the final morphology of the biomineral. Until recently, vaterite formation has been regarded as a defect and bacteria that promoted such biomineral were not considered as candidates for restoration purposes. Nevertheless, its formation has been highlighted recently from other research groups and this Thesis can be considered a further proof that bacteria stabilize vaterite that withstands sonication treatment and considered candidates for restoration techniques. Finally, Cupriavidus metallidurans ACA-DC 4073 and other isolates presented herein have not been isolated from a stone surface before. Bacillus pumilus ACA-DC 4061, although previously reported, its ability to considerably promote biomineralization of calcium carbonate has not been previously demonstrated.The presented methodology can be considered successful based on the prerequisites suggested in the first paragraph of this summary. We aimed at: •The process should not pose a negative effect upon the stone: we prove that the novel biomineral alter the substrate surface at a minimum level, while the color change can be controlled by the time of application.•Should be easily implemented: each isolate tested can be prepared for spraying in a few days. Spraying itself presents an easy approach to cover from small to large surface areas. The growth medium suggested does not include selective ingredients and can be prepared promptly.•Should be fiscally viable: The cost of the microorganism is negligible because it has been isolated from the environment, the cost of the growth medium has been reduced compared with the use of a selective medium. Furthermore, the time needed for preparation of all components does not add extra labor costs.•Should be detectable after application: the consistent formation of vaterite presents this ability of the suggested application because its crystal structure can be differentiated from other calcium carbonate minerals. The figures of the thin sections presented herein show the distinct layer of the newly formed biomineral versus the marble substrate. Finally, FT-IR analysis which is a more direct approach can differentiate among calcite and vaterite.Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή αποτελεί μια συστηματική προσπάθεια ανάπτυξης μεθόδου αποκατάστασης λίθινων μνημείων με τη χρήση μικροοργανισμών. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες η έρευνα στο συγκεκριμένο τομέα έχει ενταθεί, τόσο για να βρεθούν τρόποι συντήρησης συμβατότεροι ως προς το υπόστρωμα, όσο και για να εξακριβωθεί ο ρόλος του βακτηριακού παράγοντα στη διάβρωση, αλλά και στην εκμετάλλευση της ικανότητάς του να λειτουργεί ως πυρήνας σχηματισμού ανθρακικού ασβεστίου. Η επιδιωκόμενη μέθοδος χρειάζεται να μην επηρεάζει σημαντικά το λίθο, να είναι εύκολη και άμεση στην εφαρμογή της, οικονομικά βιώσιμη και ανιχνεύσιμη μετά την ολοκλήρωσή της, ώστε να παρακολουθείται εύκολα η πορεία χρονικά μετά την επέμβαση.Οι μικροοργανισμοί απομονώθηκαν από τα αρχαία σημεία εξόρυξης Πεντελικού μαρμάρου και από το σπήλαιο της Παιανίας, έτσι ώστε να έχουν ήδη προσαρμοστεί στο ολιγότροφο περιβάλλον του λίθου. Από την Πεντέλη η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε χειμώνα μετά από έντονη βροχόπτωση, ώστε να μειωθούν οι μικροοργανισμοί οι οποίοι είχαν πρόσφατα επικαθίσει λόγω πιθανής μεταφοράς τους μέσω του αέρα. Την ίδια εποχή έγινε και η δειγματοληψία στο σπήλαιο της Παιανίας, όπου η ροή υδάτων από την επιφάνεια προς το εσωτερικό του σπηλαίου είχε ενεργοποιήσει τη μικροχλωρίδα. Η επιλογή έγινε για ετερότροφους μικροοργανισμούς οι οποίοι δεν έχουν απαιτητικές θρεπτικές αξιώσεις για την καλλιέργειά τους, ώστε να αρκούνται σε ένα γενικό θρεπτικό μέσο, μειώνοντας έτσι το εκτιμώμενο κόστος της διαδικασίας. Αναπτύχθηκε από την αρχή πλήρως η μεθοδολογία γενετικής ταυτοποίησης για στελέχη απομονωμένα από τα συγκεκριμένα υποστρώματα, διότι οι περισσότερες δημοσιεύσεις στον τομέα, δεν στόχευαν την αλληλούχηση σχεδόν ολόκληρου του 16S rDNA, αλλά ένα μικρό μέρος του. Επομένως, για μια ολοκληρωμένη προσέγγιση, κρίθηκε απαραίτητο να πραγματοποιηθεί ακριβέστερη ταυτοποίηση των μικροοργανισμών, προσέγγιση που να καθιστά την προτεινόμενη μέθοδο αποδεκτή από το σύνολο των ερευνητών. Ακολούθησε η δημιουργία του νέου θρεπτικού διαλύματος. Δοκιμάστηκαν μια σειρά εναλλακτικών συστατικών και επιλέχθηκε ο βέλτιστος συνδυασμός για τη πλειονότητα των απομονωμένων βακτηρίων και ειδικά για αυτά που παρουσίαζαν ταχύτερο σχηματισμό ανθρακικού ασβεστίου σε στερεές καλλιέργειες. Μετά την ταυτοποίηση των μικροοργανισμών και την εξέλιξη των θρεπτικών υγρών, έγινε έλεγχος της καμπύλης ανάπτυξης όλων των βακτηρίων σε υγρές καλλιέργειες, με σκοπό να εξακριβωθεί ο χρόνος στον οποίο το κάθε στέλεχος φτάνει στη μέγιστη πληθυσμιακή του κατάσταση. Ακολούθησαν οι πρώτες δοκιμές για απόθεση ανθρακικού ασβεστίου σε στερεές και υγρές καλλιέργειες, συγκεντρώνοντας σημαντικές πληροφορίες για την πολυμορφικότητα του βιο-υλικού και για το πότε ολοκληρώνεται η διαδικασία, λαμβάνοντας εξαρχής υπόψη ότι η βελτιστοποίηση αφορά και το χρόνο ολοκλήρωσης. Τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις θρεπτικού διαλύματος δοκιμάστηκαν αρχικά και αναλύθηκε διεξοδικά η μορφολογία, το είδος του ανθρακικού ασβεστίου, το χρώμα των κρυστάλλων, καθώς και οι μεταβολές του pH, της κατανάλωσης οξικού ανιόντος και της μείωσης του κατιόντος ασβεστίου σε συνάρτηση με το χρόνο. Με αυτόν τον τρόπο επελέγησαν οι μικροοργανισμοί με τις καλύτερες προϋποθέσεις.Η επιλογή του μαρμάρου ως υπόστρωμα έγινε για τους εξής λόγους: πρώτον αποτελεί ένα υλικό από το οποίο έχουν κατασκευαστεί μνημεία πολιτιστικής κληρονομιάς παγκόσμιου βεληνεκούς, ειδικά στον Ελλαδικό χώρο, δεύτερον δεν έχει δοκιμαστεί διεξοδικά βάσει της υπάρχουσας βιβλιογραφίας για την ικανότητα απόθεσης μικροοργανισμών πάνω σε αυτό και τρίτον θεωρούμε ότι σε σχέση με πιο πορώδεις λίθους αποτελεί τη δυσκολότερη επιφάνεια στην οποία μπορούν να αποθέσουν οι μικροοργανισμοί λόγω των ελάχιστων πόρων που διαθέτει. Οι πόροι μπορούν να προσφέρουν την κατάλληλη θέση ώστε τα βακτήρια να μπορέσουν να έρθουν σε επαφή με το υπόστρωμα, να το εποικήσουν και να αρχίσουν τη διαδικασία σχηματισμού ανθρακικού ασβεστίου. Αυτή τη «φιλοξενία» το Πεντελικό μάρμαρο δεν την προσφέρει. Αντιθέτως τα μόνα σημεία, όπως θα παρουσιαστεί στα αποτελέσματα, είναι τα σημεία θραύσης των κρυστάλλων ανθρακικού ασβεστίου και όπου αλλάζουν διεύθυνση, σχηματίζοντας εσοχές. Από τα προκαταρτικά πειράματα, επιλέχθηκαν τελικά οι δύο αποδοτικότεροι μικροοργανισμοί Cupriavidus metallidurans ACA-DC 4073 και Bacillus pumilus ACA-DC 4061, λαμβάνοντας υπόψη ποσοτικές παραμέτρους, όπως συνολική απόθεση πάνω στο δοκίμιο, βιωσιμότητα του στελέχους, αλλά και ποιοτικές παραμέτρους όπως να μη μεταφέρεται χρώμα από τον μικροοργανισμό στους κρυστάλλους. Με την εφαρμογή στατιστικού σχεδιασμού πειραμάτων βελτιστοποιήθηκε η απόθεση ως προς τρεις παράγοντες: συγκέντρωση θρεπτικού, συγκέντρωση εμβολιασμού κυττάρων και θερμοκρασία. Η διαδικασία έδωσε τη δυνατότητα με μια σειρά ταυτόχρονων πειραμάτων να παρακολουθηθεί υπό ποιες συνθήκες οι μικροοργανισμοί απέδωσαν τη μέγιστη απόθεση. Οι βέλτιστες συνθήκες που εντοπίστηκαν με το σχεδιασμό ελέγχθηκαν σε επιπλέον πείραμα για την εγκυρότητά τους και τα τελικά δείγματα αναλύθηκαν για την αντοχή του αποτεθέντος υλικού με την εφαρμογή υπερήχων. Τέλος, ως ολοκλήρωση της έρευνας, οι μικροοργανισμοί εφαρμόστηκαν σε μεγαλύτερη επιφάνεια μαρμάρου με ψεκασμό, σε μη αποστειρωμένες συνθήκες, ως προκαταρκτική προσομοίωση πραγματικής εφαρμογής των αποτελεσμάτων στο περιβάλλον. Το μόνο που διατηρήθηκε σταθερό ήταν η θερμοκρασία επώασης. Και τα δύο στελέχη απέδωσαν ικανοποιητικά σε υγρές καλλιέργειες υπό τις βέλτιστες συνθήκες αλλά και κατά τον ψεκασμό τους. Όπως θα παρουσιαστεί στα αποτελέσματα, η απόθεση είναι σημαντική στην επιφάνεια του μαρμάρου και παραμένει σχεδόν ανέπαφη με την εφαρμογή των υπερήχων. Σημαντική ανακάλυψη επίσης, αποτελεί η συστηματική απόθεση βατερίτη και όχι ασβεστίτη από το σύνολο των μικροοργανισμών, με τη χρήση του προτεινόμενου θρεπτικού. Ο βατερίτης λόγω της αστάθειάς του θεωρείται ότι μετατρέπεται σχετικά σύντομα σε ασβεστίτη. Η παρέμβαση των μικροοργανισμών στη διαδικασία σχηματισμού, απέδειξε ότι ο βατερίτης παραμένει σταθερός για παρατεταμένο χρονικό διάστημα χωρίς να ανιχνεύεται κάτι διαφορετικό, ακόμα και μετά την εφαρμογή υπερήχων. Είναι μια σημαντική διαφοροποίηση, η οποία βιβλιογραφικά ξεκίνησε να γίνεται αποδεκτή μόλις πρόσφατα. Παλαιότερα, η απόθεση βατερίτη θεωρείτο μειονέκτημα και οι μικροοργανισμοί οι οποίοι σχημάτιζαν αυτή τη δομή, δεν θεωρούνταν ικανοί να αποδώσουν σε διαδικασίες προστασίας μνημείων. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στη διατριβή αποδεικνύουν όμως το αντίθετο. Από τους δύο μικροοργανισμούς που τελικά χρησιμοποιήθηκαν, ο ένας (Cupriavidus metallidurans ACA-DC 4073) δεν έχει απομονωθεί στο παρελθόν από λίθινες επιφάνειες, όπως και ορισμένα από τα υπόλοιπα στελέχη που δοκιμάστηκαν. Επιπλέον ο Bacillus pumilus ACA-DC 4061 έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία, αλλά οι δυνατότητες απόθεσής του δεν είχαν αναλυθεί διεξοδικά. Βάσει των προϋποθέσεων που τέθηκαν στην πρώτη παράγραφο της περίληψης μπορούμε να θεωρήσουμε επιτυχή τα αποτελέσματα, εφόσον η επιδιωκόμενη μέθοδος:•Απαιτείται να μην επηρεάζει σημαντικά το λίθο: η διαδικασία απόθεσης διαφοροποίησε ελάχιστα τη μορφολογία της επιφάνειας ενώ η χρωματική μεταβολή για τα επιλεγμένα στελέχη μπορεί να ελεγχθεί βάσει του χρόνου εφαρμογής της μεθόδου.•Να είναι εύκολη και άμεση στην εφαρμογή της: η προτεινόμενη προσέγγιση χρειάζεται μερικές ημέρες για να είναι το επιλεγμένο στέλεχος έτοιμο προς ψεκασμό, ενώ η χρήση του ψεκασμού καθαυτού, προσφέρει άμεση κάλυψη μεγάλης επιφάνειας. Το θρεπτικό που χρησιμοποιείται μπορεί να παρασκευαστεί εύκολα και δεν χρειάζονται εξειδικευμένα συστατικά. •Να είναι οικονομικά βιώσιμη: το κόστος του μικροοργανισμού είναι μηδαμινό, μιας και απομονώθηκε από το περιβάλλον, ενώ του θρεπτικού είναι περιορισμένο, σε σχέση με τη χρήση κάποιου εξειδικευμένου θρεπτικού, που θα χρειαζόταν ακριβότερα συστατικά. Επιπλέον, ο χρόνος παραγωγής ικανών ποσοτήτων βακτηρίου έτοιμου προς εφαρμογή, δεν θεωρείται ικανός να αυξήσει σημαντικά το κόστος.•Να είναι ανιχνεύσιμη μετά την ολοκλήρωσή της: ο συστηματικός σχηματισμός βατερίτη προσφέρει αυτή τη δυνατότητα διότι η δομή του διαφοροποιείται από τη δομή του ανθρακικού ασβεστίου, αλλά και τυχόν προσμείξεων σε λίθινα υποστρώματα, τόσο του μαρμάρου, όσο και άλλων. Οι εικόνες λεπτών τομών αναδεικνύουν αυτήν τη δυνατότητα, καθώς η νέα απόθεση διαφοροποιείται σημαντικά και είναι ευκρινής στο οπτικό μικροσκόπιο. Επίσης, η ανάλυση με FT-IR, η οποία είναι αμεσότερη, δίνει τη δυνατότητα επιβεβαίωσης της διαφοροποίησης του βατερίτη από τον ασβεστίτη