Study on the joint action of herbicides on non target photosynthetic organisms with the use of biomonitors and biomarkers

Ecotoxicology has developed rapidly in the last few years, since the use of xenobiotics has raised concerns about the health of ecosystems. Plant protection products have an exceptional position among xenobiotics. The largest percentage of plant protection products in the global market is that of herbicides. Since herbicides end up in the aquatic ecosystems, they can be very toxic to aquatic organisms, which are mainly exposed to herbicide mixtures. Thus, there is a need for studying the toxicity of herbicides in aquatic organisms, both alone and in mixtures.The current doctoral thesis aimed, first of all, to study the toxicity of the herbicides terbuthylazine, metribuzin (PSII inhibitors), tritosulfuron and tribenuron methyl (branched chain amino acid inhibitors), alone and in mixtures, to the biomonitor Lemna minor L. This was done by measuring growth, photosynthesis (via chlorophyll fluorescence) and activity of antioxidant enzymes. Secondly, it aimed at the development of a photosynthetic biosensor for the detection of PSII inhibitor herbicides.Four different growth endpoints (frond number yield, average specific growth rate of fronds, frond area yield, average specific growth rate of total frond area) were used for the estimation of the dose-response curves of the four herbicides after 7-day toxicity tests. EC50, NOEC and LOEC were calculated. The EC50 values of average specific growth rate of fronds were, indicatively: terbuthylazine 188.8 μg/l, metribuzin 70.33 μg/l, tritosulfuron 145 μg/l, και tribenuron methyl 7.57 μg/l. The magnitude of toxicity according to growth endpoints was: tribenuron methyl > metribuzin > tritosulfuron > terbuthylazine. For the study of joint toxicity, test were conducted with the following five mixture ratios of the two active substances: 0:100, 25:75, 50:50, 75:25 και 100:0. The results were analysed with the help of the Mixtox model and the isoboles for each mixture were plotted. The concentration addition-CA model accurately predicted the results of joint toxicity of the terbuthylazine and metribuzin mixture; synergism was found in the mixture of tritosulfuron and tribenuron methyl and the mixtures of terbuthylazine with tritosulfuron and metribuzin with tritosulfuron were mainly antagonistic. For all data sets concentration addition (CA) predicted mixture toxicity better than independent action (IA). The effect of PSII herbicides in chlorophyll fluorescence parameters was, as expected, much greater than that of the branched chain amino acid inhibitors. Thus, it was possible to estimate the dose-response curves for the PSII herbicides and, according to them, the sensitivity of the parameters was as follows: effective quantum yield of PSII photochemistry (ΦPSII) = electron transport rate (ETR) > photochemical quenching (qP) > maximum quantum yield of PSII photochemistry (ΦPSIIo). These parameters, with the exception of ΦPSIIo, were more sensitive than growth end points considering the toxicity of the PSII herbicides and with their use, effects could be detected within a few hours of exposure. As far as branched chain amino acid inhibitors are concerned, effective quantum yield of PSII photochemistry (ΦPSII) was the most sensitive parameter, together with non-photochemical quenching (NPQ). It was concluded that ΦPSII was the best chlorophyll fluorescence parameter for the toxicity estimation of these herbicides. For this parameter, joint toxicity had an additive effect for all mixtures tested. Antioxidant enzymes, namely peroxidase (POX), catalase (CAT), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferases (GSTs) (with three different substrates), were measured after 48 hours of exposure to terbuthylazine, tritosulfuron and their mixtures. The activity of POX, GR and GST’s was significantly increased in the highest concentrations of terbuthylazine and tritosulfuron, verifying oxidative stress existence. CAT, on the other hand, decreased in plants treated with terbuthylazine and had no difference from the control in plants treated with tritosulfuron. In addition, joint toxicity had a mainly additive effect on antioxidant enzymes. Lastly, a biosensor for the detection of PSII herbicides with immobilized thylakoides of L.minor was constructed. This was the first photosynthetic biosensor with thylakoides from L.minor. Photosynthetic material was isolated from plants and was immobilized on the surface of gold screen-printed electrodes with cross-linking into the BSA–glutaraldehyde matrix, and DCPIP was used as the artificial electron acceptor. Amperometric detection of the electric current generated by the thylakoid membranes was measured after illumination. The ratio of the signals in the presence and absence of herbicides was measured in different concentrations. Calibration curves were constructed for terbuthylazine and metribuzin and EC50 as well as LOD were calculated. LOD of terbuthylazine was 9,884*10-9 M (2,27 μg/l), slightly lower than in other studies in the literature (2,52*10-8 Μ). This biosensor could be used for screening of samples before the application, when necessary, of more expensive and complicated analytical techniques (e.g. chromatography).Ο κλάδος της οικοτοξικολογίας έχει αναπτυχθεί ταχύτατα τα τελευταία χρόνια καθώς τα προβλήματα στα οικοσυστήματα από την χρήση ξενοβιοτικών έχουν αυξηθεί εκθετικά. Ανάμεσα στα ξενοβιοτικά εξέχουσα θέση έχουν τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα, από τα οποία το μεγαλύτερο ποσοστό της παγκόσμιας αγοράς αποτελούν τα ζιζανιοκτόνα. Καθώς τα ζιζανιοκτόνα καταλήγουν στα υδάτινα οικοσυστήματα μπορούν να είναι ιδιαιτέρως τοξικά για τους υδρόβιους οργανισμούς, οι οποίοι εκτίθενται τελικά κυρίως σε μίγματα ζιζανιοκτόνων. Υπάρχει συνεπώς ανάγκη για μελέτη της τοξικότητας των ζιζανιοκτόνων σε υδρόβιους οργανισμούς, τόσο όσο αφορά στη δράση τόσο κάθε ενός μεμονωμένα όσο και των μιγμάτων τους.Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε στόχο την μελέτη της τοξικότητας των ζιζανιοκτόνων terbuthylazine, metribuzin (παρεμποδιστές του PSII), tritosulfuron και tribenuron methyl (παρεμποδιστές της βιοσύνθεσης αμινοξέων της ομάδας του πυροσταφυλλικού οξέος), τόσο ως μεμονωμένων όσο και των διαφόρων συνδυασμών τους, στον βιοδείκτη Lemna minor L. Για τον λόγο αυτό μετρήθηκε η ανάπτυξη, η φωτοσύνθεση (μέσω του φθορισμού της χλωροφύλλης) και τα αντιοξειδωτικά ένζυμα. Δευτερευόντως, στόχος ήταν η δημιουργία ενός φωτοσυνθετικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων που παρεμποδίζουν το PSII.Για την εκτίμηση των καμπυλών δόσης-απόκρισης για τα τέσσερα ζιζανιοκτόνα, μετά από τοξικολογικές δοκιμές 7 ημερών, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά κριτήρια αξιολόγησης της ανάπτυξης (αριθμός φυλλιδίων, μέσος ειδικός ρυθμός αύξησης αριθμού φυλλιδίων, επιφάνεια φυλλιδίων, μέσος ειδικός ρυθμός αύξησης επιφάνειας φυλλιδίων). Για τις καμπύλες αυτές υπολογίστηκαν τα EC50, NOEC και LOEC. Ενδεικτικά, τα EC50 για τον μέσο ειδικό ρυθμό αύξησης αριθμού φυλλιδίων ήταν: terbuthylazine 188,8 μg/l, metribuzin 70,33 μg/l, tritosulfuron 145 μg/l, και tribenuron methyl 7,57 μg/l. Η σειρά τοξικότητας σύμφωνα με την ανάπτυξη ήταν: tribenuron methyl > metribuzin > tritosulfuron > terbuthylazine.Για την μελέτη της συνδυασμένης τοξικότητας έγιναν τοξικολογικές δοκιμές με μίγματα των εκάστοτε δύο δραστικών ουσιών στις ακόλουθες πέντε αναλογίες: 0:100, 25:75, 50:50, 75:25 και 100:0. Τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν με την βοήθεια του Mixtox model και για κάθε μίγμα σχεδιάστηκαν τα αντίστοιχα ισοβολογραφήματα. Το μοντέλο της προσθετικής δράσης (CA) προέβλεψε με ακρίβεια τα αποτελέσματα του μίγματος terbuthylazine και metribuzin, στο μίγμα του tritosulfuron και του tribenuron methyl βρέθηκε συνεργισμός και τα μίγματα των terbuthylazine με το tritosulfuron και του metribuzin με το tritosulfuron είχαν κυρίως ανταγωνιστική δράση. Για όλους τους συνδυασμούς η προσθετική δράση (CA) προέβλεψε την τοξικότητα των μιγμάτων καλύτερα από την ανεξάρτητη δράση (IA).Η επίδραση των ζιζανιοκτόνων του PSII στους παραμέτρους του φθορισμού της χλωροφύλλης ήταν, όπως αναμενόταν, πολύ μεγαλύτερη από αυτή των ζιζανιοκτόνων που παρεμποδίζουν την βιοσύνθεση αμινοξέων. Ήταν, συνεπώς, δυνατό να γίνει εκτίμηση της καμπύλης δόσης-απόκρισης για τα ζιζανιοκτόνα του PSII και, σύμφωνα με αυτές, η ευαισθησία των παραμέτρων του φθορισμού είχε ως εξής: λειτουργική φωτοχημική απόδοση της φωτοχημείας του PSII (ΦPSII) = ρυθμός ροής ηλεκτρονίων στη φωτοχημική αλυσίδα (ETR) > φωτοχημική απόσβεση (qP) > μέγιστη φωτοχημική απόδοση της φωτοχημείας του PSII (ΦPSIIo). Οι παράμετροι αυτές, με εξαίρεση την ΦPSIIo, ήταν πιο ευαίσθητες, όσο αφορά στην τοξικότητα των ζιζανιοκτόνων του PSII, από τις παραμέτρους της ανάπτυξης. Επιπρόσθετα, η τοξικότητα από την χρήση τους μπορούσε να διαπιστωθεί μέσα σε λίγες ώρες από την έκθεση. Όσο αφορά στα ζιζανιοκτόνα που παρεμποδίζουν την βιοσύνθεση αμινοξέων της ομάδας του πυροσταφυλλικού οξέος, η ΦPSII μαζί με την μη φωτοχημική απόσβεση-NPQ, ήταν οι πιο ευαίσθητες παράμετροι. Από τα αποτελέσματα εξήχθει το συμπέρασμα ότι η ΦPSII ήταν συνολικά η καλύτερη παράμετρος για την εκτίμηση της τοξικότητας των υπό μελέτη ζιζανιοκτόνων. Για την παράμετρο αυτή η συνδυασμένη τοξικότητα είχε προσθετική δράση σε όλα τα μελετημένα μίγματα.Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα, συγκεκριμένα η υπεροξειδάση (POX), η καταλάση (CAT), η ρεδουκτάση της γλουταθειόνης (GR) και οι S-μεταφοράσες της γλουταθειόνης (GSTs) (με τρία διαφορετικά υποστρώματα) μετρήθηκαν μετά από έκθεση για 48 ώρες στα terbuthylazine, tritosulfuron και στα μίγματά τους. Η δραστικότητα των POX, GR και GST’s αυξήθηκε σημαντικά στις υψηλότερες συγκεντρώσεις των terbuthylazine και tritosulfuron, επιβεβαιώνοντας την ύπαρξη οξειδωτικής καταπόνησης. Από την άλλη μεριά η CAT μειώθηκε στα φυτά που εκτέθηκαν στο terbuthylazine και δεν είχε διαφορά από τον μάρτυρα στα φυτά που εκτέθηκαν στο tritosulfuron. Επιπρόσθετα, η συνδυασμένη τοξικότητα είχε κυρίως προσθετική δράση στα αντιοξειδωτικά ένζυμα.Τέλος, για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων του PSII κατασκευάστηκε βιοαισθητήρας με ακινητοποίηση θυλακοειδών της L.minor. Αυτός είναι ο πρώτος φωτοσυνθετικός αισθητήρας με θυλακοειδή από L.minor. Το φωτοσυνθετικό υλικό απομονώθηκε από τα φυτά και ακινητοποιήθηκε στην επιφάνεια ηλεκτρόδιων μεταξοτυπίας χρυσού με διαμοριακή σύνδεση γλουταραλδεΰδης-αλβουµίνης βόειου ορού, ενώ το DCPIP χρησιμοποιήθηκε ως τεχνητός ηλεκτρονιοδέκτης. Η ανίχνευση του ηλεκτρικού σήματος, που προέκυπτε από τα θυλακοειδή μετά τον φωτισμό τους, γινόταν αμπερομετρικά. Η αναλογία του σήματος κατά την παρουσία και την απουσία ζιζανιοκτόνων μετρήθηκε για διαφορετικές συγκεντρώσεις. Δημιουργήθηκαν καμπύλες βαθμονόμησης για το terbuthylazine και το metribuzin και υπολογίστηκαν τo EC50 και τα όρια ανίχνευσης (LOD). Το LOD του terbuthylazine ήταν 9,884*10-9 M (2,27 μg/l), λίγο χαμηλότερο δηλαδή από αυτό που αναφέρεται στη βιβλιογραφία (2,52*10-8 Μ). Ο βιοαισθητήρας αυτός θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για μια πρώτη διαλογή δειγμάτων πριν την εφαρμογή, στις περιπτώσεις που είναι απαραίτητο, των ακριβών και πολύπλοκων κλασικών αναλυτικών τεχνικών (π.χ. χρωματογραφία)