In vitro study of mutant prevention concentration (MPC) with clinical isolates of pseudomonas aeruginosa and resistance mechanisms for carbapenems

Purpose: To study in vitro the mutant prevention concentration (MPC) in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa which is exposed in gradually increasing imipenem/cilastatin concentrations. Additionally, to explore resistance mechanisms, which are induced during the special conditions of the experiment.Materials and methods: Sixteen susceptible to imipenem/cilastatin clinical strains of Pseudomonas aeruginosa were used. For bacterial typing the API ID32GN and ID32E system was applied. Susceptibility tests were performed using the agar disc diffusion test, the double-disc synergy test (DDST) and the EDTA-Imipenem disc synergy test. MPC was measured by inoculating 1010 initial bacterial strains in McConkey agar plates containing different imipenem concentrations (1XΜΙC – 32 mg/L). The lowest drug concentration preventing growth is the MPC. The ΜΙC of the final strains (mutants) which were recovered in the previous drug concentration before MPC was measured using the agar dilution test. The efflux pump inhibitors CCCP and PAβΝ were also applied during MIC measurements. Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) was used for epidemiological typing of the strains. PCR amplification with appropriate primers was used for β-lactamase gene detection and oprD gene sequencing. Quantitative Real Time PCR (QRT-PCR) was used for the study of oprD, mexB, mexY, mexD and ampC genes expression.Results: The great majority of the strains were susceptible to antipseudomonal antibiotics and in all strains no MBL production was detected. Epidemiological typing with PFGE demonstrated different clones. MIC values of imipenem and meropenem were 0,5-2 μg/ml and 0,25-4 μg/ml respectively. MPC values of imipenem were 4-32 μg/ml (75 % with values ≥ 16 μg/ml). The MPC/MIC ratio was 4-32 (70 % with values 8 and 16). No change in MIC values was noted after the application of efflux pump inhibitors. No significant decrease of oprD expression was noted in any final strain, compared to its initial strain. Two strains demonstrated significant (≥ x10) and other 4 borderline increase of ampC expression. Οne strain showed significant increase of all efflux pump genes expression and a borderline increase of ampC expression, while an other one had a significant increase of the efflux pump mexY expression accompanied with a borderline increase of ampC expression. OprD gene analysis of the final mutants revealed a nucleotide change that causes an aminoacid substitution (S278P), which leads to OprD loop conformational change and resistance development. In addition, 2 nucleotide substitutions in nt 360 and nt 831, 3 nucleotide deletions in positions 541, 688 and 784, an 85 bp nucleotide segment deletion in positions 1131-1215 and a 1000 bp nucleotide segment insertion in position 1060 with transposon features were discovered. These changes lead to the creation of a smaller, non-functional OprD protein and the development of resistant final mutant strains to carbapenems.Conclusions: The MPC measurement can be a useful method to reveal resistant strains, after their exposure into various antibiotic concentrations under high inoculum conditions. The systematic investigation of resistance mechanisms of these strains, may lead to a better understanding of the antibiotic actions and provide useful data for the development of new and more effective antibiotics.ΣκοπόςΣκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη προσδιορισμού της ελάχιστης συγκέντρωσης του αντιβιοτικού, που προλαμβάνει την εμφάνιση κάθε μεταλλαγμένου μικροβιακού στελέχους (Μutant Prevention Concentration, MPC) σε κλινικά στελέχη Pseudomonas aeruginosa, που υποβάλλονται in vitro σε σταδιακά αυξανόμενες συγκεντρώσεις ιμιπενέμης / σιλαστατίνης. Επιπρόσθετο στόχο αποτελεί η εξακρίβωση των μηχανισμών αντοχής του μικροβίου, που επάγονται από το αντιβιοτικό στις ιδιαίτερες συνθήκες του πειράματος.Υλικά και Μέθοδοι Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 16 ευαίσθητα στην ιμιπενέμη/σιλαστατίνη κλινικά στελέχη P.aeruginosa. Η τυποποίηση των βακτηριακών στελεχών έγινε με το σύστημα ΑΡΙ ID32GN και ID32E. Η μελέτη της ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο διάχυσης σε δίσκο σε άγαρ Mueller- Hinton, τη μέθοδο συνέργειας διπλού δίσκου (DDST) και τη μέθοδο συνέργειας δίσκων αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέως (EDTA)-Iμιπενέμης. Ο προσδιορισμός της MPC έγινε με επίστρωση 1010 κυττάρων από κάθε αρχικό μικροβιακό στέλεχος σε σειρά τρυβλίων με άγαρ ΜcConkey, που περιείχαν διαφορετικές συγκεντρώσεις ιμιπενέμης (1XMIC - 32mg/L). Ως MPC κατεγράφετο η συγκέντρωση εκείνη της ιμιπενέμης, στην οποία δεν υπήρχε καμμία ανάπτυξη του στελέχους. Μετρήθηκε η MIC, με την μέθοδο αραίωσης σε άγαρ, των αποικιών (τελικών στελεχών) που αναπτύσσονταν στην μεγαλύτερη συγκέντρωση ιμιπενέμης (δηλαδή στην αμέσως μικρότερη συγκέντρωση πριν την MPC). Η μέτρηση των MIC έγινε και με ταυτόχρονη χρήση δύο αναστολέων των αντλιών ενεργητικής αποβολής CCCP και PAβN. Η επιδημιολογική τυποποίηση των στελεχών έγινε με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε εναλλασσόμενο πεδίο ολικού DNA (PFGE). Η μέθοδος PCR με τη χρήση κατάλληλων εκκινητών, χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των γονιδίων των β-λακταμασών, καθώς και για την αλληλούχιση του γονιδίου oprD. Για την ποσοτική μελέτη της έκφρασης των γονιδίων oprD, mexB, mexY, mexD και ampC χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (QRT-PCR).ΑποτελέσματαΗ πλειονότητα των στελεχών ήταν ευαίσθητα σε όλες τις κατηγορίες αντιψευδομοναδικών αντιβιοτικών και όλα ήταν αρνητικά στη δοκιμασία ανίχνευσης παραγωγής MBL. Η επιδημιολογική τυποποίηση με PFGE κατέδειξε διαφορετικούς κλώνους. Η διακύμανση των MIC στην ιμιπενέμη ήταν 0,5-2 μg/ml και στη μεροπενέμη 0,25-4 μg/ml.Οι τιμές της MPC της ιμιπενέμης ήταν 4-32 μg/ml (το 75 % είχε τιμές ≥ 16 μg/ml). Το πηλίκο MPC/MIC των στελεχών αυτών ήταν από 4 έως 32 (το 70 % είχε τιμές 8 και 16). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στις ΜΙC των αντιβιοτικών που ελέγχθηκαν παρουσία καθενός από τους αναστολείς αντλιών ενεργητικής αποβολής (εκροής). Σε κανένα τελικό στέλεχος δεν παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της έκφρασης του oprD (≤ 30 %) σε σχέση με το αντίστοιχο αρχικό κλινικό του στέλεχος. Δύο στελέχη παρουσίασαν σημαντική αύξηση (≥ x10) και άλλα 4 οριακή αύξηση στην παραγωγή του ampC. Ένα στέλεχος παρουσίασε αυξημένη έκφραση όλων των αντλιών εκροής και οριακή αύξηση της έκφρασης του ampC, ενώ ένα άλλο παρουσίασε αυξημένη έκφραση μόνον της αντλίας εκροής mexY και οριακή αύξηση της έκφρασης του ampC. Ο γονιδιακός έλεγχος του oprD στα τελικά στελέχη απεκάλυψε την αμινοξική αλλαγή S278P, που οδηγεί σε αλλαγή διαμόρφωσης βρόγχου της ΟprD και σε αύξηση της αντοχής. Επίσης ανευρέθησαν 2 νουκλεοτιδικές αλλαγές στα nt 360 και nt 831, 3 ελλείψεις νουκλεοτιδίων στις θέσεις 541, 688 και 784 , μία έλλειψη ενός τμήματος νουκλεοτιδίων 85 bp στις θέσεις 1131-1215 και μία εισδοχή στη θέση 1060 ενός τμήματος νουκλεοτιδίων 1000 bp με χαρακτήρες μεταθετού στοιχείου (transposon). Oι αλλαγές αυτές οδηγούν στη δημιουργία μίας μικρότερης και μη λειτουργικής πρωτεΐνης OprD και επίσης σε αύξηση της αντοχής των τελικών στελεχών στις καρβαπενέμες. ΣυμπεράσματαΗ εφαρμογή της MPC μπορεί να αποτελέσει μία χρήσιμη μέθοδο ανάδειξης ανθεκτικών στελεχών, μετά από έκθεσή τους σε διάφορες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού υπό συνθήκες υψηλού ενοφθαλμίσματος. Η συστηματική διερεύνηση των μηχανισμών αντοχής των στελεχών αυτών μπορεί να βοηθήσει στην βαθύτερη κατανόηση της δράσης των αντιβιοτικών και στην ανάπτυξη νέων πιο ισχυρών αντιμικροβιακών ουσιών