Study of the role of endothelial progenitor cells (EPCs) in atheromatous disease

It is known that, platelets play a major role in hemostasis, inflammation and angiogenesis. Endothelial progenitor cells (EPCs) are a population of pluripotent stem cells which have the ability to differentiate into mature endothelial cells (ECs). EPCs contribute significantly in the regeneration of the vascular endothelium and neovascularization. Furthermore, they express surface antigens CD34, CD133 and KDR. CD34 and CD133 are markers of progenitor cells, whereas KDR identifies cells with endothelial phenotype. Consequently, the definition of EPCs is complex due to the absence of a unique specific cell marker. Furthermore, a specific and sensitive method for the characterization and identification of EPCs has not yet been developed in the international scientific community. However, several types of circulating EPCs, depending on the method of isolation and culture, have been described in bibliography. These include colony forming unit-Hill (CFU-Hill) cells, and circulating angiogenic cells (CACs) which are called early EPCs, as well as late-outgrowth endothelial progenitor cells (OECs) that are late EPCs. In the present study, we initially developed methods for the isolation and culture of EPC populations for the first time in our laboratory. Then, we wanted to investigate the potential effect of the above types of EPCs on platelet activation in vitro.Initially, peripheral blood mononuclear cells were isolated and cultured under different conditions to lead to the formation of CFU-Hill and CACs cells. Moreover, CD34+ cells were isolated from cord blood mononuclear cells and appropriately cultured for 30-days for differentiation into OECs. Then, we performed characterization and identification of the above types of EPCs using light inverted microscope, flow cytometry, and finally confocal microscopy. It was found that, CFU-Hill cells formed colonies with a defined central cluster of round cells and elongated spindle-like cells in the periphery. CACs were rounded cells whereas some of them acquired spindle-shaped morphology. OECs better resemble mature endothelial cells from umbilical cord (HUVECs) since they display typical cobblestone morphology and they have high proliferative capacity. Finally, CD34+ cells appeared to be small with round shape. Next, we performed the characterization of the three types of EPCs for the expression of cell surface antigens. CFU-Hill cells expressed CD34, KDR, CD133. Moreover, they expressed the panleukocyte marker CD45 and the monocyte marker CD14, indicating their hematopoietic nature. Finally, they expressed CD31, a specific endothelial antigen. Similarly, CACs expressed CD34, KDR, CD133, CD31 including CD45 and CD14, suggesting that these cells exhibit haematopoietic characteristics. In general, OECs showed expression of CD34, KDR, CD31 and only a small percentage expressed the immature marker CD133. On the other hand, OECs did not express at all the hematopoietic markers CD14 and CD45, showing that these cells exhibit strong endothelial phenotype. An important finding is that, the endothelial phenotype of OECs appears to be much stronger as cell passage is increased. Finally, we characterized EPCs performing experiments with confocal microscopy. CFU-Hill were found positive for DiI-acetylated LDL (DiI-ac-LDL) uptake and FITC-lectin binding. CACs stained positive with both ac-LDL and lectin. Furthermore, CACs stained with von Willebrand factor (vWF). Similarly, OECs stained with ac-LDL, lectin, and vWF.Since we performed the characterization and identification of EPCs, the effect of those cells and their supernatant on washed platelet aggregation was studied with the light transmittance aggregometry method. CD34+ and HUVECs cells and their supernatant were also studied. Collagen, thrombin and trap14 were used as platelet agonists. Both the CFU-Hill cells and their supernatant did not inhibit platelet aggregation in the presence of collagen or thrombin. Similarly, CACs cells and their supernatant did not exhibit any inhibitory activity on platelet aggregation induced by collagen or Trap14. On the other hand, OECs cells and their supernatant inhibited platelet aggregation induced by collagen or Trap14. The inhibitory effect of OECs on platelet aggregation was similar to that induced by HUVECs, since OECs express strong endothelial phenotype. It was found that, OECs cells, unlike early EPCs exhibit increased expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and secrete various antiplatelet factors, such as nitric oxide (NO) and prostaglandin I2 (PGI2). Therefore, the supernatant of OECs is able to inhibit platelet aggregation. The increased degree of endothelial phenotype was found to be associated with higher percentage of antiplatelet activity. Furthermore, OECs cells inhibited platelet aggregation in a dose- and time-dependent manner. Finally, a very important original finding of this study is that the OECs cells and their supernatant exhibited higher inhibition on washed platelet aggregation in the presence of Trap14 compared to collagen. This phenomenon may be due to the fact that EPCs and particularly late EPCs express PAR-1 receptor. Both CD34+ cells and their supernatant did not inhibit platelet aggregation by thrombin. Conclusively, only OECs cells and their supernatant showed inhibition of platelet aggregation displaying strong antiplatelet activity. Therefore, we wanted to study further the effect of OECs and their supernatant on platelet activation using flow cytometry.We studied the effect of OECs and their supernatant on platelet activation induced by agonist ADP. Platelet activation was evaluated by determining the integrin-receptor αIIbβ3 membrane expression (PAC-1-FITC binding) and P-selectin membrane expression (CD62P-PE). Platelets were stained with platelet marker CD61-PerCP and OECs with endothelial marker CD31-PE. The effect of HUVECs cells and their supernatant, as well as CD34+ cells on platelet activation was also studied. It was found that, platelets that are not attached to CD34+, OECs and HUVECs cells, are activated. OECs and HUVECs cells, as well as their supernatant inhibited non-adherent platelet activation. On the contrary, CD34+ cells and their supernatant did not inhibit non-adherent platelet activation. Platelet activation with ADP induces platelet adherence to OECs, CD34+ and HUVECs cells. It was observed that, platelets that are adherent either to OECs or to HUVECs cells are not activated. The above phenomenon was not noticed in CD34+ cells.In summary, the present study shows for the first time that OECs cells and their supernatant exhibit potent antiplatelet activity. The importance of the above findings on the mechanisms of atheromatosis remain under investigation.Είναι γνωστό ότι, τα αιμοπετάλια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αιμόσταση, στη φλεγμονή και στην αγγειογένεση. Τα πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα (EPCs) είναι ένας πληθυσμός πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων τα οποία έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs). Τα EPCs συνεισφέρουν σε σημαντικό βαθμό στην αναγέννηση του αγγειακού ενδοθηλίου και στην επανενδοθηλιοποίηση. Επιπρόσθετα, εκφράζουν στην επιφάνειά τους τα αντιγόνα CD34, CD133 και KDR. Τα CD34 και CD133 είναι δείκτες πρόδρομων κυττάρων, ενώ το KDR ταυτοποιεί τα κύτταρα με ενδοθηλιακό φαινότυπο. Συνεπώς, ο ορισμός των EPCs είναι σύνθετος εξαιτίας της απουσίας ενός μοναδικού εξειδικευμένου δείκτη. Επιπλέον, πρέπει να τονιστεί ότι, στη διεθνή επιστημονική κοινότητα δεν έχει αναπτυχθεί ακόμη μια εξειδικευμένη και ευαίσθητη μεθοδολογία για το χαρακτηρισμό και την ταυτοποίηση των EPCs. Εντούτοις, διάφορες κατηγορίες των κυκλοφορούντων EPCs έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία οι οποίες βασίζονται σε διαφορετικές μέθοδοι απομόνωσης και καλλιέργειας. Τα EPCs ταξινομούνται στα colony forming unit-Hill (CFU-Hill) κύτταρα και τα κυκλοφορούντα αγγειογενετικά κύτταρα (CACs), τα οποία ονομάζονται early EPCs, όπως επίσης και στα προχωρημένης ωρίμανσης EPCs (OECs) ή late EPCs. Στην παρούσα μελέτη, θελήσαμε να αναπτύξουμε μεθόδους απομόνωσης και καλλιέργειας των διαφόρων τύπων EPCs για πρώτη φορά στο εργαστήριο μας. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση των EPCs στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, in vitro.Αρχικά, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και καλλιέργεια των μονοπύρηνων κυττάρων από περιφερικό αίμα κάτω από διαφορετικές συνθήκες έτσι ώστε να οδηγηθούμε στη δημιουργία των CFU-Hill και CACs κυττάρων. CD34+ κύτταρα απομονώθηκαν από μονοπύρηνα κύτταρα αίματος από ομφάλιο λώρο και καλλιεργήθηκαν κατάλληλα για 30 μέρες ώστε να οδηγηθούμε στο σχηματισμό των OECs κυττάρων. Στη συνέχεια, ακολούθησε ο χαρακτηρισμός των τριών κατηγοριών των EPCs χρησιμοποιώντας το οπτικό ανάστροφο μικροσκόπιο, την τεχνική της κυτταρομετρίας ροής, καθώς και τη μικροσκοπία συνεστιασμού. Βρέθηκε ότι, τα CFU-Hill κύτταρα είχαν την ικανότητα σχηματισμού αποικιών που αποτελούνταν από ένα κεντρικό σύμπλεγμα σφαιρικών κυττάρων με επιμήκη κύτταρα στην περιφέρεια. Τα CACs ήταν σφαιρικά κύτταρα ενώ μερικά από αυτά ήταν ατρακτοειδή. Τα OECs μοιάζουν ως προς τη μορφολογία με τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιου λώρου (HUVECs) αφού αυτά εμφανίζουν μια τυπική ελλειψοειδή μορφή και παρουσιάζουν υψηλή ικανότητα πολλαπλασιασμού και εξάπλωσης. Τέλος, τα CD34+ κύτταρα ήταν μικρά με σφαιρικό σχήμα. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε το χαρακτηρισμό των τριών κατηγοριών των EPCs ως προς την έκφραση διαφόρων επιφανειακών αντιγόνων. Τα CFU-Hill κύτταρα παρουσίασαν έκφραση των CD34, KDR και CD133. Επιπλέον, εμφάνισαν έκφραση του γενικού δείκτη των λευκοκυττάρων CD45 και του μονοκυτταρικού δείκτη CD14, υποδεικνύοντας την αιμοποιητική τους φύση. Τέλος, βρέθηκε ότι εκφράζουν CD31, ένα εξειδικευμένο ενδοθηλιακό αντιγόνο. Παρομοίως, τα CACs παρουσίασαν έκφραση των CD34, KDR, CD133, CD31, όπως επίσης των CD45 και CD14, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά εμφανίζουν αιμοποιητικά χαρακτηριστικά. Γενικά, βρέθηκε ότι τα OECs εκφράζουν CD34, KDR, CD31 και μόνο ένα μικρό ποσοστό τον πρόδρομο δείκτη CD133. Από την άλλη πλευρά, τα OECs δεν παρουσίασαν καθόλου έκφραση των αιμοποιητικών δεικτών CD14 και CD45, δείχνοντας ότι τα συγκεκριμένα κύτταρα εμφανίζουν ισχυρό ενδοθηλιακό φαινότυπο. Ένα σημαντικό εύρημα είναι ότι, ο ενδοθηλιακός φαινότυπος των OECs φαίνεται να είναι ισχυρότερος καθώς αυξάνεται η γενιά των κυττάρων. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση των EPCs με μικροσκοπία συνεστιασμού. Τα CFU-Hill είχαν την ικανότητα πρόσληψης της DiI-ακετυλιωμένης LDL (DiI-ac-LDL) και δέσμευσης της FITC-λεκτίνης. Επίσης, έγινε χρώση των CACs με τον παράγοντα von Willebrand (vWF). Ακολούθησε χρώση των OECs με την ac-LDL, τη λεκτίνη και τον vWF.Αφού πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός και η ταυτοποίηση των EPCs, η επίδραση των κυττάρων και του υπερκειμένου τους στη συσσώρευση των πλυμένων αιμοπεταλίων μελετήθηκε με τη συσσωρευομετρία οπτικής διαπερατότητας. Μελετήθηκαν επίσης τα CD34+ και τα HUVECs κύτταρα, καθώς και το υπερκείμενό τους. Ως αγωνιστές των αιμοπεταλίων χρησιμοποιήθηκαν το κολλαγόνο, η θρομβίνη και το Trap14. Τόσο τα CFU-Hill κύτταρα όσο και το υπερκείμενό τους δεν ανέστειλαν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων παρουσία του κολλαγόνου ή της θρομβίνης. Παρομοίως, τα CACs κύτταρα και το υπερκείμενό τους δεν εμφάνισαν ανασταλτική δράση στη συσσώρευση η οποία προκλήθηκε από το κολλαγόνο ή το Trap14. Από την άλλη πλευρά, τα OECs κύτταρα και το υπερκείμενό τους ανέστειλαν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων από το κολλαγόνο ή το Trap14. Η ανασταλτική δράση των OECs στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων ήταν παρόμοια με αυτή των HUVECs, αφού τα OECs εκφράζουν ισχυρό ενδοθηλιακό φαινότυπο. Η ανασταλτική δράση που εμφανίζει το υπερκείμενο των OECs πιθανώς οφείλεται στο γεγονός ότι τα OECs κύτταρα, σε αντίθεση με τα early EPCs παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση της ενδοθηλιακής συνθάσης του νιτρικού οξειδίου (eNOS) και εκκρίνουν διάφορες αντιαιμοπεταλιακοί παράγοντες, όπως μονοξείδιο του αζώτου (NO) και προσταγλανδίνη Ι2 (PGI2). Ο αυξανόμενος βαθμός του ενδοθηλιακού φαινοτύπου βρέθηκε να συσχετίζεται με υψηλότερο ποσοστό αντιαιμοπεταλιακής δράσης. Επιπλέον, διαπιστώθηκε δοσοεξαρτώμενη και χρονοεξαρτώμενη ανασταλτική δράση της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων από τα OECs κύτταρα. Τέλος, ένα πολύ σημαντικό πρωτότυπο εύρημα αυτής της μελέτης είναι ότι τα OECs κύτταρα, καθώς και το υπερκείμενό τους παρουσίασαν αυξημένη αναστολή από το Trap14 παρά από το κολλαγόνο. Ο λόγος για τον οποίο ενδεχομένως μπορεί να ισχύει αυτό είναι γιατί τα EPCs και ιδιαίτερα τα late EPCs εκφράζουν τον PAR-1. Τόσο τα CD34+ κύτταρα όσο και το υπερκείμενό τους δεν ανέστειλαν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων από τη θρομβίνη. Συμπερασματικά, μόνο τα OECs κύτταρα και το υπερκείμενό τους ανέστειλαν τη συσσώρευση εμφανίζοντας ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δράση. Για αυτό το λόγο, θελήσαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω την επίδραση των συγκεκριμένων κυττάρων και του υπερκειμένου τους στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων χρησιμοποιώντας την κυτταρομετρία ροής.Στη συνέχεια, ερευνήθηκε η επίδραση των OECs και του υπερκειμένου τους στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων από τον αγωνιστή ADP. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων εκτιμήθηκε προσδιορίζοντας τη μεμβρανική έκφραση του υποδοχέα-ιντεγκρίνης αIIbβ3 (πρόσδεση PAC-1-FITC) και τη μεμβρανική έκφραση της P-σελεκτίνης (CD62P-PE). Έγινε χρώση των αιμοπεταλίων με τον αιμοπεταλιακό δείκτη CD61-PerCP και των OECs με τον ενδοθηλιακό δείκτη CD31-PE. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση των HUVECs κυττάρων και του υπερκειμένου τους, καθώς επίσης και των CD34+ κυττάρων στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Βρέθηκε ότι, τα ελεύθερα αιμοπετάλια τα οποία δεν είναι προσκολλημένα στα CD34+, OECs και HUVECs κύτταρα ενεργοποιούνται. Τα OECs, καθώς και τα HUVECs κύτταρα και τα υπερκείμενά τους ανέστειλαν την ενεργοποίηση των ελεύθερων αιμοπεταλίων. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε αναστολή στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων από τα CD34+ κύτταρα και το υπερκείμενό τους. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με ADP επάγει την προσκόλλησή τους στα OECs, στα CD34+ και στα HUVECs κύτταρα. Διαπιστώθηκε ότι, τα προσκολλημένα αιμοπετάλια είτε στα OECs είτε στα HUVECs κύτταρα δεν ενεργοποιούνται. Το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρήθηκε στα CD34+ κύτταρα.Συνοπτικά, η παρούσα μελέτη δείχνει για πρώτη φορά ότι τα OECs κύτταρα και το υπερκείμενό τους εμφανίζουν ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δράση. Η σπουδαιότητα των παραπάνω ευρημάτων στους μηχανισμούς της αθηρωμάτωσης παραμένουν υπό διερεύνηση