Investigation of resistance of staphylococcus to oxazolidones and streptogrammins with phenotypic and molecular methods

Staphylococcus is one of the most important pathogens implicated in infections. With the emergence and dissemination of MRSA in hospitalized patients and in the community, therapy for staphylococcal infections has become increasingly difficult due to their resistance to antibiotics. Glycopeptides have been the drugs of choice for treating multiresistant staphylococci. However, with the emergence of intermediate susceptibility to glycopeptides, other treatment alternatives such as linezolid and quinupristin/dalfopristin have become important. Linezolid is the first member of the oxazolidone class of antimicrobials and quinupristin/dalfopristin is a combination of streptogramin B and A compounds. The aim of this thesis was to investigate the in vitro susceptibility of staphylococci against linezolid and quinupristin/dalfopristin and to detect the molecular basis of the responsible resistance mechanisms. A total of 475 clinical isolates, comprising 140 S. aureus and 335 CoNS were collected from AHEPA Hospital, between 2005-2007. Each isolate was identified at species level by Gram stain, catalase and coagulase tests and by Vitek 2 system. Methicillin resistance of isolated staphylococci was detected by the presence of PBP2a protein with Slidex MRSA test (Biomerieux). Of the 140 S. aureus 50 (36%) strains were methicillin-resistant (MRSA) and of the 335 CoNS isolates 255 (76%) were methicillin resistant. Susceptibility testing for various antimicrobial agents was performed by broth microdilution method using the automated system Vitek2. The MICs of linezolid and quinipristin/dalfopristin were determined for the clinical isolates by Etest according to manufacturer’s instructions. The classification of isolates as susceptible or resistant was carried out according to the CLSI criteria. The susceptibility test results for staphylococci showed that linezolid remains active against this microorganism. Linezolid inhibited all isolates at concentrations between 0.19-3mg/l. The modal linezolid MIC for S. aureus and CoNS was 1.18mg/l and 0.87mg/l respectively. The linezolid MIC₅₀ and MIC₉₀ values for S. aureus and CoNS were 0.75 mg/I, 1mg/l and 0.5mg/l, 0.80 mg/I respectively. Of 475 strains 12 S. aureus and 13 CoNS were found to express low level resistance to quinupristin/dalfopristin (MIC=1-4mg/l) and 3 isolates (1 S. epidermidis, 2 S. cohnii) were resistant (MIC>4mg/l). Isolates with MICs≥1mg/l were tested for the presence of genes encoding resistance to streptogramin A [vat(A,B,C), vga(A,B)] and streptogramin B[vgb(A,B), erm(A,B,C), msr(A,B)] by PCR. PCR detected the following resistance genes: 11 CoNS isolates carried the vgaA gene, 12 CoNS isolates carried the ermA gene, 7 S. aureus isolates carried the ermC gene and 2 S. aureus isolates carried the ermA gene. The 11 vgaA positive isolates were identified to the species level by a molecular method based on the tuf gene followed by sequencing analysis. Molecular identification showed the same results for 10 out of 11 isolates, except for one strain which initially was identified as S. epidermidis with Vitek2 but finally turned to be S. haemolyticus. Clonality of resistant isolates (7 S. epidermidis, 4 S. haemolyticus, 2 S. cohnii) was assessed by pulsed-field-gel-electrophoresis (PFGE) after digestion of chromosomal DNA with Smal. PFGE results showed that all S. epidermidis isolates were clonally related, belonging to the same clone. Each isolate of S. haemolyticus and S. cohnii expressed a different clone. In the present study all staphylococcal isolates were susceptible to linezolid which indicates that this antimicrobial agent is a promising therapeutic option. The surveillance for the detection of possible resistant strains needs to be continual with the use of the appropriate methods. The emergence of CoNS isolates resistant to quinipristin/dalfopristin should be a matter of special concern. Our study pointed out that the implementation of molecular methods is necessary for the documentation of resistance to Q/D, especially in cases of low level resistance. This thesis aspires to serve as a basis for the surveillance of staphylococci resistance against linezolid and quinipristin/dalfopristin antibiotics. Prudent use of these drugs is indispensable in an era of rapidly growing resistance.Οι σταφυλόκοκκοι αποτελούν ένα από τα συχνότερα αίτια λοιμώξεων σε όλο τον κόσμο. Η εμφάνιση και εξάπλωση των μεθικιλλίνη ανθεκτικών στελεχών (MRSA & MRCoNS) ανάμεσα στους ενδονοσοκομειακούς ασθενείς αλλά και στην κοινότητα, δημιούργησε μεγάλο προβληματισμό ως προς την αντιμετώπιση τους, αφού έχουν την τάση να εμφανίζουν αντοχή σε πολλά αντιβιοτικά. Οι οξαζολιδόνες και οι στρεπτογραμμίνες με κύριους αντιπροσώπους την λινεζολίδη και την κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη αποτελούν δύο καινούργιες τάξεις αντιμικροβιακών φαρμάκων που εισήλθαν στην κλινική θεραπευτική τα τελευταία χρόνια για την αντιμετώπιση των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων. Τόσο οι μελέτες που προηγήθηκαν της εισαγωγής των δύο φαρμάκων όσο και οι επιδημιολογικές μελέτες που ακολούθησαν, ήταν πολύ ικανοποιητικές και για τα δύο φάρμακα. Τα ποσοστά αντοχής που αναφέρθηκαν στην διεθνή βιβλιογραφία ήταν πολύ χαμηλά. Δεδομένου ότι η εισαγωγή των φαρμάκων αυτών στον ελληνικό χώρο έγινε το 2002, η παρούσα διατριβή σχεδιάστηκε με σκοπό την καταγραφή της αντοχής των σταφυλόκοκκων και στα δύο φάρμακα καθώς και τη διερεύνηση του μηχανισμού αντοχής στα ανθεκτικά στελέχη. Αποτελεί μια πρώτη καταγραφή της συμπεριφοράς των δύο φαρμάκων στο χώρο του νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ και φιλοδοξεί να χρησιμεύσει ως βάση για επιτήρηση της αντοχής του σταφυλόκοκκου στα συγκεκριμένα αντιβιοτικά. Για το σκοπό αυτό εξετάσθηκαν 475 στελέχη σταφυλόκοκκων, τα οποία απομονώθηκαν από υλικά ασθενών που νοσηλεύτηκαν στο Νοσοκομείο ΑΧΕΠΑ κατά την χρονική περίοδο 2005-2007. Η ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με τις κλασικές μεθόδους (χρώση Gram-δοκιμασία καταλάσης - δοκιμασία παραγωγής πηκτάσης) και τον αναλυτή Vitek 2. Από τα 475 στελέχη 140 ήταν S. aureus και 335 πηκτάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι. Η αντοχή στη μεθικιλλίνη πραγματοποιήθηκε με έλεγχο παραγωγής της πρωτεΐνης PBP2a. Η αντοχή στα αντιβιοτικά ελέγχθηκε με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων με τον αναλυτή Vitek 2. Ο προσδιορισμός της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (MIC) στη λινεζολίδη (LZ) και στην κινοπριστίνη-νταλφοπριστίνη(Q/D) έγινε με τη μέθοδο του Etest και τα όρια ευαισθησίας καθορίστηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια του CLSI. Το ποσοστό των MRSA ήταν 36% και των CoNS ανθεκτικών στη μεθικιλλίνη 76%, ποσοστά που συμβαδίζουν με προηγούμενες μελέτες στο Νοσοκομείο ΑΧΕΠΑ. Η αντοχή των σταφυλόκοκκων στα αντιβιοτικά κυμάνθηκε από 20% στην τριμεθοπρίμη-σουλφομεθοξαζόλη έως 64,4% στο φουσιδικό οξύ. Κατά τον έλεγχο ευαισθησίας της λινεζολίδης δεν βρέθηκαν στελέχη σταφυλόκοκκου με MIC>4mg/L που αποτελεί το όριο αντοχής στο αντιβιοτικό, σύμφωνα με το CLSI. Τα MRSA στελέχη εμφάνισαν χαμηλότερες τιμές MIC στη λινεζολίδη σε σχέση με τα MSSA. Η μέση τιμή της MIC ήταν 1.18 mg/L για τον S.aureus και 0.87 mg/L για τους CoNS. Κατά τον έλεγχο ευαισθησίας στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη βρέθηκαν 12 στελέχη S.aureus και 12 στελέχη CoNS με ενδιάμεση ευαισθησία (MIC=1-4 mg/L) και 3 στελέχη με αντοχή (1 S. epidermidis, 2 S..cohnii). Όλα τα στελέχη που είχαν MIC≥1 mg/L στην Q/D μελετήθηκαν με PCR για την ανίχνευση των γονιδίων που ευθύνονται για την αντοχή των σταφυλόκοκκων στις στρεπτογραμμίνες [vat(A,B,C), vga(A,B), vgb(A,B), erm(A,B,C) και msr(A,B) ]. Σε 11 στελέχη των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων ανιχνεύτηκε το γονίδιο vgaA(7 S. epidermidis, 4 S. haemolyticus). Σε 12 από τα 13 στελέχη των πηκτάση αρνητικών σταφυλόκοκκων ανιχνεύτηκε το γονίδιο ermA. Τα 12 στελέχη S. aureus με τιμές MIC από 1 έως 2 mg/L ήταν αρνητικά για την ύπαρξη γονιδίων που κωδικοποιούν αντοχή στην νταλφοπριστίνη (vga και vat). Σε 7 στελέχη S.aureus ανιχνεύτηκε το γονίδιο erm(C), σε 2 στελέχη S. aureus το γονίδιο erm(A) και 3 στελέχη ήταν αρνητικά. Στα vga θετικά στελέχη έγινε μοριακή ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους βάσει του γονιδίου tuf. Η μοριακή ταυτοποίηση έδωσε τα ίδια αποτελέσματα για τα 10 από τα 11 στελέχη, ενώ ένα στέλεχος το οποίο αρχικά είχε ταυτοποιηθεί ως S. epidermidis με το αυτοματοποιημένο σύστημα Vitek2, με τον μοριακό έλεγχο βρέθηκε S. haemolyticus. Η γενετική συγγένεια των στελεχών σταφυλόκοκκου που παρουσίαζαν αντοχή στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη μελετήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE). Μελετήθηκαν 7 στελέχη S. epidermidis, 4 στελέχη S. haemolyticus και 2 στελέχη S. cohnii. Από την ανάλυση των ζωνών της PFGE σύμφωνα με τα κριτήρια του Tenover βρέθηκε ότι τα στελέχη S. epidermidis ανήκαν σε έναν κλώνο, ενώ τα στελέχη S. haemolyticus και S. cohnii ήταν πολυκλωνικά. Στην παρούσα μελέτη η in vitro δραστικότητα της λινεζολίδης ήταν 100% έναντι των στελεχών σταφυλόκοκκου, γεγονός ιδιαίτερα ενθαρρυντικό. Το γεγονός αυτό δεν πρέπει να δημιουργήσει εφησυχασμό καθώς στη διεθνή βιβλιογραφία οι περιπτώσεις εμφάνισης ανθεκτικών στελεχών αυξάνονται. Η εμφάνιση στελεχών CoNS με αντοχή στην κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη προβληματίζει. Η μελέτη έδειξε ότι είναι απαραίτητη η τεκμηρίωση της φαινοτυπικής αντοχής με μοριακές μεθόδους για την αναζήτηση των υπεύθυνων γονίδιων, ειδικά στις περιπτώσεις με χαμηλού επιπέδου αντοχή (ΜΙC=1-4 mg/L). Η προσεκτική χρήση των νεότερων αντιμικροβιακών φαρμάκων όπως η λινεζολίδη και η κινοπριστίνη/νταλφοπριστίνη είναι θεμελιώδους σημασίας και η επαγρύπνηση του μικροβιολογικού εργαστηρίου για την ανίχνευση της αντοχής με τις κατάλληλες μεθόδους είναι απαραίτητη