Identificación y caracterización de desubiquitinasas que modulan el receptor de neurotrofinas TrkA

[ES]El receptor TrkA es una proteína tirosina quinasa que se activa por la unión de la neurotrofina denominada Factor de Crecimiento Nervioso (NGF) desencadenando diferentes cascadas de señalización (Arévalo JC. & Wu SH., 2006). La señalización del receptor TrkA está modulada por distintos mecanismos para asegurar su correcto funcionamiento biológico. Uno de estos mecanismos es la ubiquitinación, que es una modificación post-traducional reversible en la que se añade una o varias ubiquitinas a proteínas (Komander D. et al., 2009). Una vez activado por NGF, el receptor TrkA se internaliza entrando a formar parte del tráfico endocítico. En este proceso, la ubiquitinación juega un papel fundamental, ya que si TrkA es ubiquitinado por ubiquitina E3 ligasas, será dirigido a la degradación lisosomal, pero si por el contrario, el receptor es desubiquitinado por desubiquitinasas, será reciclado a la membrana plasmática (Chen ZY. et al., 2005). Trabajos previos describen a Nedd4-2 (Arévalo JC. et al., 2006; Yu T. et al., 2011; Georgieva MV. et al., 2011; Yu T. et al., 2014), TRAF6 (Geetha T. et al., 2005) y Cbl (Takahashi Y. et al., 2011) como proteínas ubiquitina E3 ligasas responsables de la ubiquitinación de TrkA. Teniendo en cuenta que no se conocen las enzimas implicadas en el reciclaje de TrkA a la membrana plasmática, nosotros queremos determinar qué desubiquitinasas están implicadas en el reciclaje de TrkA hacia la membrana plasmática. De ese modo, se avanzaría en el conocimiento de los mecanismos relacionados con la regulación de TrkA que son de gran relevancia debido a la vinculación de los receptores Trk con diversas enfermedades humanas (Chao MV. et al., 2006). Para ello, se desarrolló un ensayo de identificación de desubiquitinasas en el que se transfectaron células PC12 6/15 que expresan TrkA usando una Librería comercial (Dharmacon siGENOME® SMARTpool® siRNA Library) que contiene cuatro siRNA para cada DUB. Posteriormente, se dio un pulso durante 10 minutos con NGF y se recogieron muestras a 15 y a 60 minutos que se analizaron mediante la técnica de Western blot. Se consideró que todas las DUBs que a 60 minutos tenían menos TrkA activado que en la condición control podrían ser responsables del reciclaje de TrkA. De las DUBs candidatas se continuó con el estudio de USP36. Mediante la reducción de los niveles de Usp36 por el uso de vectores lentivirales producidos a partir de las secuencias usadas en el ensayo de identificación, se vio un incremento de la activación y señalización de TrkA a tiempos cortos, después de un pulso de 10 minutos con NGF, que fue debido al incremento de los niveles de TrkA. Además, mediante ensayos de inmunoprecipitación, se vio que TrkA interacciona con Usp36, que USP36 reduce los niveles de ubiquitinación de TrkA y que en presencia del mutante sin actividad catalítica de USP36 no se revierte el efecto en los niveles de ubiquitinación de TrkA. Además, mediante ensayos de desubiquitinación ¿in vivo¿, se determinó que el efecto de USP36 sobre TrkA no era directo. Teniendo en cuenta estudios previos realizados en nuestro laboratorio (Arévalo JC. et al., 2006; Yu T. et al., 2011; Yu T. et al., 2014) en los que describen a Nedd4-2 como una E3 ubiquitina ligasa que ubiquitina a TrkA, optamos por estudiar si USP36 podría estar afectando a la actividad de Nedd4-2 sobre TrkA. Lo primero que se observó fue que Usp36 y Nedd4-2 interaccionan y que Usp36 afectaba a la ubiquitinación de Nedd4-2 y viceversa. Además, el incremento en la ubiquitinación de USP36 mediado por la actividad catalítica Nedd4-2 promovía una disminución de los niveles de expresión de Usp36, sin embargo, la disminución de los niveles de ubiquitinación de Nedd4-2 mediada por Usp36 no afectaba a los niveles de expresión de Nedd4-2. También, se desarrollaron ensayos de ¿pulldown¿ en los que se observó USP36 interaccionaba con los dominios WW de Nedd4-2. Teniendo en cuenta estudios previos en los que describen que TrkA interacciona con los mismos dominios WW (Arévalo JC. et al., 2006), consideramos que TrkA y USP36 podrían estar compitiendo por la interacción con Nedd4-2 ya que, además, en células PC12 6/15 con USP36 reducido, TrkA interacciona más con Nedd4-2 que en células control. Finalmente, estudiamos si la competencia entre TrkA y USP36 por la interacción con Nedd4-2 afecta a la actividad de Nedd4-2 sobre TrkA. Y vimos que los niveles de ubiquitinación de TrkA mediados por Nedd4-2 se reducían en presencia tanto de USP36 como de su mutante catalítico. Además, vimos mediante un ensayo de ubiquitinación ¿in vitro¿ que el efecto de USP36 sobre la ubiquitinación de TrkA mediada por Nedd4-2 era directo. Por todo ello, podemos decir que USP36 reduce los niveles de ubiquitinación de TrkA mediante la modulación de la actividad de Nedd4-2