Desarrollo de una vacuna contra Fasciola hepatica basado en el empleo de herramientas de bioinformática

[ES]La infección causada por Fasciola hepatica es una trematodosis ampliamente distribuida en el mundo, causando importantes pérdidas económicas a nivel veterinario. Se estima que hay 17 millones de personas infectadas y que entre 91 a 170 millones de personas residen en zonas con posibilidad de adquirir la enfermedad. El triclabendazol continúa siendo el fármaco de elección para el tratamiento de la fasciolosis tanto a nivel veterinario como en humanos. La aparición de estirpes resistentes al triclabendazol hacen que la vacunación sea una prioridad para la prevención de la enfermedad. En el presente estudio, realizamos una búsqueda de todas las proteínas de Fasciola hepatica que se encontraban descritas en el servidor web del Centro Nacional de Información en Biotecnología (NCBI). Una vez obtenidas la secuencia de aminoácidos de las proteínas encontradas, seleccionamos aquellas que presentaban péptido señal y ausencia de regiones transmembrana. A partir de su secuencia de aminoácidos y haciendo uso de las herramientas de bioinformática BepiPred y SYFPEITHI diseñamos 12 péptidos con epítopos B y 12 péptidos con epítopos T, los cuales fueron sintetizados químicamente empleando una metodología de síntesis de péptidos en fase sólida. Los estudios in vitro utilizando macrófagos peritoneales de ratón mostraron que los péptidos sintéticos no presentan citotoxicidad en el rango de concentraciones utilizadas en este estudio. Estudiamos la respuesta inmunológica inducida en ratones BALB/c inmunizados con los péptidos sintéticos utilizando el sistema ADAD de vacunación, previamente descrito y utilizado en nuestro grupo de investigación. Analizamos la producción de anticuerpos de los tipos IgG, IgG1, IgG2a, IgE e IgM en diferentes tiempos durante el procedimiento de inmunización, comparando el efecto tanto de los péptidos (B o T) como del inmunomodulador utilizado (AA0029 o PAL). Evaluamos los niveles de citocinas de los tipos Th1, Th2, Treg y Th17 en sobrenadantes de cultivo de esplenocitos de ratones inmunizados con los péptidos sintéticos, así como cambios en los niveles de subpoblaciones de linfocitos B y T y subpoblaciones linfocitarias asociadas a la generación de memoria inmunológica. Aplicando un análisis estadístico univariante y multivariante seleccionamos los péptidos denominados B1, B2, B5, B6, T14, T15 y T16 que pertenecen a proteínas de amebaporo y catepsina B de F. hepatica. Además, el análisis estadístico demostró que el uso del imunomodulador AA0029 induce, en general, una respuesta inmunológica más potente que el inmunomodulador PAL. Para los estudios de protección, los péptidos fueron administrados individualmente y, de acuerdo al tipo de respuesta inmunológica inducida, se realizaron combinaciones de los péptidos. Cuando los ratones inmunizados fueron infectados con metacercarias de F. hepatica, obtuvimos diferentes niveles de protección medidos como porcentaje de supervivencia, recuperación de vermes y magnitud del daño hepático. La inmunización de ratones con la combinación de los péptidos T14, T15 y T16 produjo una supervivencia del 71,4%, así como una reducción significativa en el número de vermes y en la magnitud de las lesiones hepáticas. Estos datos indican que el uso de múltiples antígenos es necesario para obtener mejores resultados de protección. Finalmente, analizamos el transcriptoma en esplenocitos de ratones inmunizados con dicha combinación de péptidos mediante la tecnología de microarrays de Affymetrix, encontrando que la inmunización aumenta la expresión de genes implicados en rutas de señalización sobre producción de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno, así como de rutas de señalización de Il-12 e IL-8. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que el uso de péptidos sintéticos procedentes de diferentes moléculas del parásito pueden ser posibles candidatos vacunales contra la fasciolosis causada por F. hepatica. Sin embargo, futuros estudios de inmunización en modelos naturales de fasciolosis deben ser realizados para validar nuestros resultados