Epidemiological, clinical, immunological, hematological, therapeutical study of HIV-1 infected greek patients

Anemia is the most common hematologic abnormality, observed in patients with HIV-1 and AIDS, which may have serious implications that vary from functional and quality-of-life decrements to an accelerating progression of the disease and increased risk of death. Several mechanisms are related to anemia, and in a previous retrospective study, composed in the Pathophysiology Department, it has been suggested, that circulating autoantibodies to endogenous erythropoietin (anti-Epo), who were present in a substantial percentage (23.4%) of patients with HIV-1 infection, are an independent predictor of anemia. The above mentioned study due to its retrospective design did not elucidate whether anti-Epo autoantibodies preceded the development of anemia or were simply a concomitant marker of the disease process. The first part of this MD thesis was designed in order to elucidate the above mentioned question. The longitudinal cohort study which was undertaken, consisted of HIV-1 infected patients, who were consecutively screened for the presence of circulating anti-Epo antibodies at the Infectious Disease Unit of the Athens Laikon Hospital. Blood samples were obtained at each patient visit for flow cytometric measurements of CD4+ T lymphocytes, viral load, and other laboratory studies. Erythropoietin serum levels were measured by radioimmunobloting assay, while the anti-Epo were detected by an ELISA assay developed in the laboratory of Pathophysiology Department. The study population consisted of 113 HIV seropositive patients (96 male and 17 female) with mean age ± SD 33.8 ± 12.7 years. Anti-Epo antibodies were detected in 46 (41%) of the patients. Out of 27 patients with anemia 19 (70%) had anti-Epo antibodies as compared with 27 (31%) of 86 patients without anemia (odds ratio [OR], 5.19; 95% confidence interval [CI], 2.02 to 13.3). Epo levels were significantly higher among patients with anemia [median (interquartile range) was 31.3 (40.1) vs 19.4 (13.7) IU/ml, p=0.006], compared to patients without anemia. In univariable analysis the presence of anemia was positively associated with a variety of clinicolaboratory parameters, anti-Epo antibodies included, whilst in multivariable logistic regression analysis, after adjusting for confounders, only anti-Epo antibodies were significantly associated with the presence of anemia (odds ratio [OR], 5.07; 95% confidence interval [CI], 1.25 to 20.49). The patients had a mean ± SD follow up of 105 months ± 40 months, for a total of 2190 visits (average 19.4 visits/patient, range 2-36). Anti-Epo activity and Epo concentrations were measured on 1094 and 1024 visits respectively. Anti-Epo antibodies were associated with higher serum Epo for all visits [45.7 ± 60.4 vs. 31.8 ± 31.7 IU/ml, p<0.001]. On multivariable GEE (generalized estimated equations) analysis, the presence of anti-Epo antibodies, after adjustment for other independent covariates, revealed that anti-Epo positive individuals were twice more likely to become anemic than their seronegative counterparts. Anti-Epo antibodies prevalence declined from 41% (46/113) at enrollment to 29.3% (320/1094) for all visits, in parallel with the prevalence of anemia which dropped from 24% at presentation to 12.8% (279/2184 visits) for all visits, as HAART therapy was increasingly implemented. In fact, anti-Epo prevalence was inversely associated with the severity of immunosuppression reflected by the CD4 count and the use of HAART therapy. In conclusion, the previous study’s data were confirmed and furthermore it is demonstrated that antibodies to endogenous Epo are a strong predictor of anemia in HIV-1 infected patients. HAART reduces the prevalence of both anemia and anti-Epo antibodies. Correlation of the autoantibodies with anemia was confirmed but their role remained obscure, due to the inability of clarifying whether their presence is instrumental for the pathogenesis of anemia or exist as an epiphenomenon along with other circulating autoantibodies in HIV-1 infection, which have no clinical significance and appear as a result of the persistent activation of the immune system. This finding lead to the design of the second part of this MD thesis, which was designed to explain the function, if any, of the anti-Epo in the pathophysiology of HIV-1-related anemia, through the detection of specific epitopes on the erythropoietin molecule, where anti-Epo are directed. Serum samples (n=32) from several HIV-1 positive patients were obtained (16 patients were anti-Epo positive and 16 were anti-Epo negative) and in addition sixteen sera from age- and sex- matched healthy blood donors were used as negative controls. Epitope mapping was conducted by the synthesis of twelve 20-mer peptides, overlapping by seven amino acids, covering the entire sequence of Epo. Sera from anti-Epo positive patients exhibited significant reactivity with the following Epo epitopes: Ep1, Ep5 and Ep12. Ep1 (1-20aa) and Ep12 (147-166aa) peptides, both exhibited significant reactivity with 13 of the 16 sera from anti-Epo positive patients, while ELISA with Ep1 and Ep12 peptides exhibited high sensitivity (81.2%) and specificity (93.7%). Furthermore, Ep5 peptide which corresponds to the 53-72 region of Epo also reacted significantly with 14/16 of the anti-Epo positive sera with high sensitivity (87.5%) and specificity (93.7%). Sera from anti-Epo patients, as well as from negative controls, exhibited no significant reactivity against any peptide. The specificity of binding of antibodies to the major epitope analogues was assessed by homologous inhibition experiments, where the reactivity of sera with Ep1, Ep5, Ep12 was inhibited by 47%, 46% and 43% respectively. In advance, the study of the Epo immunodominant regions structural characteristics, permitted us to assess that the two major antigenic epitopes, Ep1 and Ep12, located at the amino (NH2-) and the carboxy (C-) terminus of the molecule respectively, form a consecutive antigenic interface for the antibody binding. Ep1 and Ep12 comprise the interaction interface with erythropoietin receptor (EpoR). Essential precondition for the biological activity of Epo is its binding to the erythropoietin receptor, and it is likely that binding of anti-Epo to this specific region can block the Epo-EpoR interaction resulting to blunted erythropoiesis. Identification of the primary sequence of Epo epitopes allowed the use of protein databases to search sequence similarities with proteins of unrelated origin. Search results revealed that the epitope APPRLICDSRVLERYLLEAK (1-20) had 63% (12/19) similarity to a fragment (34LVCASRELERFAVNPGLLE52) of HIV-1 gag polyprotein. This amino-acid sequence corresponds to a region of p17 matrix protein (MA), which is one of the three major proteins that Gag polyprotein is consisted of. The sequence similarity observations prompted us to the construction of a new peptide (HIV1-gag) having the exact sequence with the region corresponding to matrix protein. A different peptide with the same amino-acid bases to HIV-1-gag peptide in a scrambled order (VLREFARVPENLGESLCAL) was constructed to be used as control. Both constructed peptides and Ep1 peptide were tested against selected sera from HIV-1 patients with and without anti-Epo. Experiment results showed that all sera binding to Ep1 peptide recognized the HIV-1-gag but not the p17 scrambled peptide. These results suggest that anti-Epo presence can be attributed to a molecular mimicry mechanism. Furthermore, inhibition tests were conducted with both peptides, which exhibited inhibition rates varying between 50% and 62%, results suggesting that Ep1 and HIV-1-gag peptides cross-react. Finally laboratory findings of the studied sera were examined showing significant higher Epo levels [53.63 (27.32) vs. 25.15 (9.49) ng/ml, p<0.001] and lower Hgb levels [11.8 (1.7) vs. 14 (1.4) g/dl, p<0.001] in the anti-Ep1 positive group in comparison with the anti-Ep1 negative group. In addition 9/13 (69%) of anti-Ep1 positive patients were anemic and only 4/19 (21%) of the other group (p<0.05). Noteworthy is that reactivity levels of anti-Epo positive sera are similar between Ep1 and Ep12 peptides [Spearman’s rank correlation coefficient (rs)= 0.93, p< 0.0001]. According to the above observations the significant higher serum levels of Epo, which were detected in anti-Epo positive patients sera even in the previous study, can be interpreted as a result of the blockade of the Epo-EpoR interaction leading to blunted erythropoiesis and reactive production of greater amounts of Epo. In conclusion this study demonstrates that anti-Epo autoantibodies are directed against specific linear B-cell epitopes located within the binding site of the molecule to its receptor and possess high disease sensitivity and specificity. One of the Epo epitopes (Ep1) shows molecular similarity with p-17 matrix protein of HIV-1; therefore the presence of anti-Epo in HIV-1 infected patients can be attributed to molecular mimicry mechanism.Η αναιμία αποτελεί την συνηθέστερη αιματολογική επιπλοκή που παρατηρείται στους ασθενείς με HIV-1 λοίμωξη και AIDS, και έχει συσχετισθεί με επιπλοκές που κυμαίνονται από την επιδείνωση της λειτουργικότητας και την επιβάρυνση της ποιότητας ζωής των ασθενών έως και την επιτάχυνση της εξέλιξης της νόσου και την αύξηση του κινδύνου θανάτου. Τα αίτια της αναιμίας ποικίλουν και μεταξύ αυτών καταδείχθηκε, σε παλαιότερη αναδρομική μελέτη του τμήματος της Παθολογικής Φυσιολογίας, ότι τα κυκλοφορούντα αυτοαντισώματα έναντι της ενδογενούς ερυθροποιητίνης (αντί-Εpo) που ανιχνεύθηκαν σε σημαντικό ποσοστό (23.4%) ασθενών με HIV-1 λοίμωξη, αποτελούν ανεξάρτητο παράγοντα πρόγνωσης της αναιμίας. Η προαναφερθείσα μελέτη λόγω του αναδρομικού χαρακτήρα της, δεν απαντούσε πειστικά στο ακόλουθο ερώτημα: τα αυτοαντισώματα έναντι της ερυθροποιητίνης προηγούνται της ανάπτυξης της αναιμίας και σχετίζονται με αυτήν ή είναι απλώς ένας επακόλουθος δείκτης της εξέλιξης της νόσου; Το πρώτο μέρος της παρούσης διδακτορικής διατριβής σχεδιάστηκε με στόχο να δώσει απάντηση στο παραπάνω ερώτημα. Η μελέτη που εκπονήθηκε είχε προοπτικό χαρακτήρα και ο πληθυσμός της αποτελούνταν από οροθετικούς ασθενείς που εξετάσθηκαν κατά σειρά για την παρουσία των κυκλοφορούντων αυτοαντισωμάτων στο Εργαστήριο Λοιμωδών Νόσων της Παθολογικής Φυσιολογίας στο Λαϊκό Νοσοκομείο Αθηνών. Δείγματα αίματος λαμβάνονταν σε κάθε επίσκεψη των ασθενών για μετρήσεις κυτταρομετρίας ροής των CD4+ Τ λεμφοκυττάρων, του ιικού φορτίου και άλλων εργαστηριακών παραμέτρων. Επίσης μετρούνταν τα επίπεδα ερυθροποιητίνης του ορού με την μέθοδο της ραδιοανοσοκαθήλωσης, ενώ η ανίχνευση των αντί-Εpo έγινε με μέθοδο ELISA που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο της Κλινικής Παθολογικής Φυσιολογίας. Ο πληθυσμός της μελέτης αποτελούνταν από 113 HIV οροθετικούς ασθενείς (96 άνδρες και 17 γυναίκες) με μέσο όρο ηλικίας 33.8 ± 12.7 έτη. Αντισώματα αντί-Εpo ανιχνεύθηκαν σε 46 (41%) ασθενείς, ενώ κατά την έναρξη της μελέτης, αναιμία βρέθηκε σε 27 (24%) από τους 113 ασθενείς της μελέτης. Από τους 27 ασθενείς με αναιμία, 19 (70%) είχαν αντισώματα αντί-Εpo.Η επίπτωση των αντί-Epo στους 86 ασθενείς χωρίς αναιμία αφορούσε τους 27 (31%) εξ’ αυτών ([OR], 5.19∙ 95% [CI], 2.02-13.3). Τα επίπεδα της ερυθροποιητίνης ήταν σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς με αναιμία (μέση ενδοτεταρτημοριακή διακύμανση) 31.3 (40.1) έναντι 19.4 (13.7) IU/ml, p=0.006) στους ασθενείς χωρίς αναιμία. Στη μονοπαραγοντική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε, η παρουσία της αναιμίας, σχετιζόταν σαφώς με μια πλειάδα κλινικοεργαστηριακών παραμέτρων συμπεριλαμβανομένων των αντί-Εpo, ενώ στην πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης, μετά την προσαρμογή των συντελεστών, μόνο τα αντί-Εpo σχετίστηκαν σημαντικά με την παρουσία αναιμίας ([OR], 5.07∙ 95% [CI], 1.25-20.49). Οι ασθενείς είχαν μέσο όρο ± SD παρακολούθησης 105 μηνών ± 40 μήνες, σε ένα σύνολο 2190 επισκέψεων (μέσος όρος 19.4 επισκέψεις/ ασθενή, διακύμανση 2-36). Η δραστηριότητα των αντί-Εpo και οι συγκεντρώσεις της Εpo μετρήθηκαν σε 1094 και 1024 επισκέψεις αντίστοιχα. Τα αυτοαντισώματα σχετίστηκαν με υψηλότερη Εpo ορού σε όλες τις επισκέψεις (45.7±60.4 έναντι 31.8±31.7 IU/ml, p<0.001). Στην πολυπαραγοντική GEE (generalized estimated equations) ανάλυση μετά την προσαρμογή για άλλες ανεξάρτητες μεταβλητές, τα άτομα με θετικά αντί-Εpo εμφάνιζαν διπλάσιο κίνδυνο να αναπτύξουν αναιμία σε σχέση με τους οροαρνητικούς συμμετέχοντες. H επίπτωση των αντί-Εpo αντισωμάτων μειώθηκε από 41% (46/113) συνολικά στο 29.3 % (320/1094) σε όλες τις επισκέψεις, παράλληλα με την εμφάνιση της αναιμίας η οποία μειώθηκε από το 24% κατά την έναρξη στο 12.8% (279/2184 επισκέψεις) σε όλες τις επισκέψεις, καθώς όλο και περισσότεροι ασθενείς λάμβαναν HAART. Κατά την διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης, η επίπτωση των κυκλοφορούντων αυτοαντισωμάτων συσχετίστηκε αντιστρόφως ανάλογα της σοβαρότητας της ανοσοκαταστολής, όπως αυτή αντικατοπτρίζεται από τον αριθμό των CD4, και της χρήσης της HAART. Συμπερασματικά επιβεβαιώθηκαν τα ευρήματα της προηγούμενης μελέτης και καταδείχθηκε ότι η παρουσία των κυκλοφορούντων αυτοαντισωμάτων έναντι της ερυθροποιητίνης αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη ανάπτυξης συμπτωματικής αναιμίας στην πορεία του χρόνου, ενώ η εφαρμογή της HAARΤ μειώνει την επίπτωση τόσο της αναιμίας όσο και των αυτοαντισωμάτων. Η συσχέτιση των αυτοαντισωμάτων με την αναιμία τεκμηριώθηκε, όμως ο ρόλος τους παρέμεινε αδιευκρίνιστος, διότι δεν είναι σαφές εάν συμμετέχουν στην παθογένεση της αναιμίας ή απλά υφίστανται ως επιφαινόμενο όπως και πολλά άλλα αυτοαντισώματα στην HIV λοίμωξη, που στερούνται κλινικής σημασίας και οφείλονται στην συνεχή ανοσιακή διέγερση. Το γεγονός αυτό αποτέλεσε την αφορμή για την εκπόνηση του δεύτερου μέρους της διατριβής με στόχο την διευκρίνιση του λειτουργικού ή όχι ρόλου των αντί-Εpo στην παθοφυσιολογία της HIV-1 αναιμίας, μέσω της αναζήτησης ύπαρξης ειδικών επιτόπων του μορίου της ερυθροποιητίνης στους οποίους δρουν τα αυτοαντισώματα. Για την μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι οροί 32 ασθενών με HIV-1 λοίμωξη (16 εξ’ αυτών είχαν αντί-Epo), καθώς και 16 οροί υγιών αιμοδοτών που χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες. Ο έλεγχος της ύπαρξης επιτόπων πραγματοποιήθηκε μέσω της σύνθεσης 12 αλληλεπικαλυπτόμενων εικοσαμερών συνθετικών πεπτιδίων, που κάλυπταν το σύνολο της αλληλουχίας του μορίου της ερυθροποιητίνης. Οι οροί των ασθενών που ήταν θετικοί για την παρουσία αντί-Εpo εμφάνισαν σημαντική δραστικότητα έναντι των επιτόπων Ep1, Ep5 και Εp12 της ερυθροποιητίνης, με τα πεπτίδια Ep1 (1-20aa) και Ep12 (147-166aa) να επιδεικνύουν δραστικότητα στους 13 από τους 16 ορούς ασθενών και την ευαισθησία και ειδικότητα της ELISA που χρησιμοποιήθηκε να είναι 81.2% και 93.7% αντίστοιχα, ενώ 14 οροί ασθενών εμφάνισαν σημαντική δραστικότητα έναντι του Ep5 (53-72aa) με υψηλή ευαισθησία (87.5%) και ειδικότητα (93.7%). Οι οροί τόσο των οροθετικών ασθενών δίχως αυτοαντισώματα, όσο και των υγιών μαρτύρων δεν εμφάνισαν καμία αξιοσημείωτη δραστικότητα έναντι των πεπτιδίων. Η ειδικότητα της σύνδεσης των αντισωμάτων στους κύριους επιτόπους τεκμηριώθηκε με ομόλογα πειράματα αναστολής, όπου η δραστικότητα των ορών με Ep1, Ep5 και Εp12 ανεστάλη σε ποσοστά 47%, 46% και 43% αντίστοιχα. Ακολούθως μελετήθηκαν τα δομικά χαρακτηριστικά των ανοσοεπικρατών περιοχών του μορίου της ερυθροποιητίνης, όπου έγινε αντιληπτό, πως οι δύο κύριοι αντιγονικοί επίτοποι Ep1 και Ep12, που καταλαμβάνουν τo άμινο- και καρβόξυ- τελικό άκρο του μορίου αντίστοιχα, συγκροτούν μια συνεχόμενη αντιγονική επιφάνεια πάνω στην οποία συνδέονται τα αυτοαντισώματα. Επίσης διαπιστώθηκε πως οι επίτοποι Ep1 και Ep12 καταλαμβάνουν το τμήμα του μορίου της ερυθροποιητίνης που αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα της (EpoR). Η ερυθροποιητίνη μπορεί να δράσει μόνο μέσω της σύνδεσής της με τον υποδοχέα της, οπότε η προσκόλληση των κυκλοφορούντων αυτοαντισωμάτων σε αυτή την περιοχή πιθανώς παρεμποδίζει την αλληλεπίδραση της Epo με τον υποδοχέα της, και οδηγεί σε αναποτελεσματική ερυθροποίηση. Η αναγνώριση των αλληλουχιών των επιτόπων της ερυθροποιητίνης επέτρεψε την αναζήτηση, σε πρωτεϊνικές βάσεις δεδομένων, ομοιοτήτων τους με άλλες άγνωστες πρωτεΐνες Τα αποτέλεσμα αυτής της αναζήτησης κατέδειξαν πως ο επίτοπος Ep1 (APPRLICDSRVLERYLLEAK) εμφανίζει μοριακή ομοιότητα κατά 63% (12/19) με το πρωτεϊνικό θραύσμα 34LVCASRELERFAVNPGLLE52 της gag πολυπρωτεΐνης του HIV-1. Η παραπάνω αλληλουχία αμινοξέων αντιστοιχεί σε ένα τμήμα καθεμίας εκ των τριών κύριων δομικών πρωτεϊνών του ιού, στην p17 πρωτείνη του στρώματος (matrix). Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις κατασκευάσθηκε νέο συνθετικό πεπτίδιο (HIV-1-gag) πανομοιότυπης αλληλουχίας με αυτή της p17 καθώς και ένα ακόμη που είχε τα ίδια αμινοξέα, τοποθετημένα σε διαφορετικές θέσεις (VLREFARVPENLGESLCAL) το οποίο χρησίμευσε ως μάρτυρας. Τα δύο αυτά πεπτίδια όπως και το Ep1 εξετάστηκαν ως προς την δραστικότητά τους σε επιλεγμένους ορούς οροθετικών ασθενών με ή χωρίς αντισώματα έναντι της ερυθροποιητίνης και καταδείχθηκε πως οι οροί των ασθενών που συνδέονται με το πεπτίδιο Ep1 αναγνωρίζουν και το HIV-1-gag, όχι όμως και το πεπτίδιο-μάρτυρα. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν πως η παρουσία των αντί-Epo, μπορεί να οφείλεται στον μηχανισμό της μοριακής μίμησης. Τα πειράματα αναστολής που πραγματοποιήθηκαν με τα δύο πεπτίδια ήταν επιτυχή, εμφανίζοντας ποσοστά αναστολής μεταξύ 50% και 62%, επιβεβαιώνοντας την υπόθεση της ύπαρξης διασταυρούμενων αντιδράσεων μεταξύ τους. Τέλος εξετάστηκαν εργαστηριακές παράμετροι των δύο ομάδων ασθενών και διαπιστώθηκε πως οι ασθενείς με αντισώματα έναντι του επιτόπου Ep1 σε σχέση με αυτούς που δεν είχαν, εμφάνιζαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ερυθροποιητίνης [53.63 (27.32) vs. 25.15 (9.49) ng/ml, p<0.001] και χαμηλότερα επίπεδα αιμοσφαιρίνης [11.8 (1.7) vs. 14 (1.4) g/dl, p<0.001]. Επιπλέον 9/13 (69%) αντί-Εp1 ασθενείς είχαν αναιμία και μόνο 4/19 (21%) από την άλλη ομάδα (p<0.05). Αξιοσημείωτο είναι πως τα δραστικά επίπεδα των πεπτιδίων Ep1 και Ep12 στους ασθενείς με αντί-Εpo ήταν παρόμοια [Spearman’s rank correlation coefficient (rs)= 0.93, p< 0.0001]. Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις, τα αυξημένα επίπεδα ερυθροποιητίνης των ασθενών με αντί-Epo αντισώματα, που είχαν ανιχνευθεί και στην πρώτη μελέτη και των οποίων ο ρόλος δεν ήταν δυνατόν να ερμηνευθεί επαρκώς, πιθανότατα οφείλονται στην δράση των αντισωμάτων που παρεμποδίζουν την σύνδεση Epo-EpoR με αποτέλεσμα να είναι αναποδοτική η ερυθροποίηση και αντιδραστικά να παράγονται μεγαλύτερες ποσότητες ερυθροποιητίνης. Συμπερασματικά η παρούσα μελέτη κατέδειξε πως τα αντισώματα έναντι της ερυθροποιητίνης κατευθύνονται εναντίον ειδικών γραμμικών Β-κυτταρικών επιτόπων που εντοπίζονται στο σημείο σύνδεσης του πρωτεϊνικού μορίου της ερυθροποιητίνης με τον υποδοχέα της Οι επίτοποι αυτοί εμφανίζουν μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα. Ένας εξ αυτών των επιτόπων, ο Ep1 εμφανίζει σημαντική μοριακή ομοιότητα με την p17 πρωτεΐνη του HIV-1, οδηγώντας στο συμπέρασμα πως η παρουσία των αντί-Epo αυτοαντισωμάτων μπορεί να αποδοθεί στον μηχανισμό της μοριακής μίμησης