Immunohistochemical evaluation of the biological molecules TGF-β1, BMP-2 osteopontin, HGFa in malignant salivary gland neoplasms

Malignant growth is essentially characterized by an uncontrolled tissue remodeling process in which normal tissue is substituted by cancer tissue. Interaction between tumor and stromal cells plays a major role in cancer progression. Tumor cells can reside in the stroma and modify it, they can alter the connective tissue, modulate the metabolism of stroma cells thus creating a convenient environment. In addition the tumor stroma contains a rich cellular population, which includes fibroblasts, endothelail cells, macrophages and other inflammatory cells. Malignant cells interact with the microenviroment through the release of soluble factors p.ex. integrins, TGF, IL6,IL8, HGF. Several studies have demonstrated high concentrations of growth factors in malignant tumors of the brest, stomach, endometrium, melanoma. Only 3-6% of head and neck tumors occur in the salivary glands. Salivary gland neoplasms show a striking range of morphological and histological diversity between different tumor types and sometimes within an individual tumor mass. The histological classification of salivary gland tumors is under the consideration of the world health organization. Prognosis strongly correlates with the clinical stage (tumor size, local invasion, metastasis regional or distant) and histopathological grade, emphasizing the importance of early diagnosis. PURPOSE. The purpose of this study was the immunohistochemical evaluation of TGF-β1, BMP-2, HGFa, OST expression in salivary gland malignant neoplasms and the correlation with clinical and histopathological parameters (age, sex, TNM system). MATERIAL AND METHODS. The material consisted of 54 specimens of malignant salivary gland tumors from the Oral and Maxilofaciall Surgery Department of “Evangelismos” General Hospital in Athens during the years 1996-2008 The specimens were fixed in 10% formalin for more than 24 hours. The antibodies used for immunohistichemical evaluation were: 1. TGF-β1 (sc-52893, Santa Cruz Biotechnology, Inc) mouse monoclonal antibody in working dilution 1: 50. Positive controls: thyroid gland tissue 2. HGFa (sc-7949, Santa Cruz Biotechnology, Inc) rabbit polyclonal antibody working dilution 1:150. Positive control gall bladder tissue 3. Osteopontin (E-3284, Spring Bioscience) rabbit polyclonal antibody in working dilution 1: 100. Positive control: breast cancer tissue 4. BMP-2/4 (BAF-355,R&DSystems) goat monoclonal antibody in working dilution 1: 150. Positive control: thyroid glad tissue RESULTS. The results of this study were the following: Of the 54 cases, 29 (53.7%) were males and 25 (46.3%) females with mean age 53.4 years. The tumors were classified as follows: 19 adenoid cystic carcinomas. 7 (13.0%) of them were high grade carcinomas and 12 (22.2%) intermediate grade, 13 mucoepidermoid carcinomas. 2 (3.7%) were high grade, 3 (5.6%) intermediate grade and 8 (14.8%) low grade mucoepidermoid carcinomas 5 (9.3%) polymorphous low grade adenocarcinomas, 2 (3.7%) adenocarcinomas not otherwise specified, 1 (1.9%) salivary duct carcinoma, 3 (5.6%) mucinous adenocarcinomas, 1 (1.9%) carcinoma ex pleomorphic adenoma, 4 (7.4%) basal cell adenocarcinomas, 6 (11.1%) myoepithelial carcinomas. The tumors (stage I- IVA) were located intraoraly and extraoraly as well. The expression of TGF-β1 in malignant salivary gland neoplasms was weak and focal. Weak positive immunohistochemical stain (+) was observed in 33.3%. Mesenchimal cells expressed a weak immunohistichemical stain (+) in 37.0% of the cases. Statistical analysis also revealed correlation between the expression of TGF-β1 in stroma cells and the stage of the tumors. Intense expression of TGF-b1 was observed in high stage neoplasms. Positive immunohistochemical stain of BMP-2 (++) was observed in 3.7% of the malignant salivary gland neoplasms and weak expression (+) in 53.7%. The only significant correlation observed with the HGF-a expression. Osteopontin expression was also focal and didn’t extend in all tumor area. Intense positive immunohistochemical stain (+++) was observed in 9.25% of salivary gland tumors and (++) in 14.8%. The study revealed correlation between osteopontin expression and tumor location and age of the patients. Last HGF-a expression was moderate and extended in all the tumor mass. The stain was located in the cytoplasm of epithelial cancer cells. Positive immunohistochemical stain (++) was observed in 14.81% of the malignant salivary gland neoplasms and weak expression (+) in 68.51%. Statistical analysis revealed significant correlation was between HGFa expression and gender of patients, tumor stage and BMP-2 expression. CONCLUSIONS. The results of this study revealed the expression of the biological molecules (TGF-β1, ΒΜΡ-2, OST, HGF-a) in salivary gland malignant neoplasms. The statistical analysis of the results demonstrated a significant correlation between the expression of these factors and clinical and pathological parameters such as age and gender of patients, tumor location and tumor stage. In conclusion these results have provided a useful data for further investigation on the important role of these biomarkers in tumor progression.Η ανάπτυξη ενός κακοήθους όγκου χαρακτηρίζεται κυρίως από την χωρίς έλεγχο αναδιαμόρφωση (remodeling) των ιστών, μια διαδικασία με την οποία παρατηρείται αντικατάσταση του φυσιολογικού από παθολογικό ιστό. Η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων αλλά και η πορεία εξέλιξής τους επηρεάζεται όπως είναι γνωστό από αλληλεπιδράσεις που πραγματοποιούνται μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και στοιχείων του υποστρώματος. Τα καρκινικά κύτταρα αλληλοεπιδρούν με τα κύτταρα του υποστρώματος μέσω πρωτεϊνών της κυτταρικής μεμβράνης, αλλά και με την έκκριση αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών όπως ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας, ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού, οι ιντερλευκίνες IL-1, IL-6, IL-8, η οστεοποντίνη, ο ηπατοκυτταρικός αυξητικός παράγοντας κ.α.). Οι παράγοντες αυτοί έχει αποδειχθεί ότι τροποποιούν τη δράση των ινοβλαστών αλλά και φλεγμονωδών κυττάρων προάγοντας την μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό τους και την παραγωγή αντίστοιχων αυξητικών παραγόντων, κυτταροκινών και πρωτεασών από αυτά Σε υποστήριξη των υποθέσεων αυτών έρχονται παρατηρήσεις αυξημένων επιπέδων κυτταροκινών σε καρκινώματα μαστού, στομάχου, ενδομητρίου, καρκίνων του εγκεφάλου, γλοιωμάτων, μελανωμάτων κ.α. Αν και μόλις το 3-6% των όγκων της περιοχής κεφαλής τραχήλου παρουσιάζονται στους μείζονες και ελάσσονες σιαλογόνους αδένες παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία ιστολογικών χαρακτηριστικών. Η ταξινόμηση των όγκων των σιαλογόνων αδένων βρίσκεται κάτω από την αιγίδα της παγκόσμιας οργάνωσης υγείας ενώ η πρόγνωση των όγκων εξαρτάται από κλινικούς (ηλικία, θέση εντόπισης, μέγεθος όγκου, λεμφαδενικές μεταστάσεις) αλλά και ιστοπαθολογικούς παράγοντες. ΣΚΟΠΟΣ. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση της έκφρασης των βιολογικών μορίων TGF-β1, BMP-2, Οστεοποντίνης και HGFa σε κακοήθεις όγκους των σιαλογόνων αδένων και η διερεύνηση πιθανής συσχέτισης των παραπάνω μορίων με ιστοπαθολογικές και κλινικές παραμέτρους όπως αυτές προκύπτουν από τα ιστορικά και τις παθολογοανατομικές εκθέσεις των παρασκευασμάτων. ΥΛΙΚΟ- ΜΕΘΟΔΟΣ. Το υλικό της μελέτης αποτελείται από 54 δείγματα καρκινικών ιστών και συλέχθηκε μετά από μελέτη των φακέλων ασθενών με κακοήθη όγκο των σιαλογόνων αδένων που νοσηλεύτηκαν και χειρουργήθηκαν στην Πανεπιστημιακή Κλινική Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής του Γ.Ν.Α. «Ο Ευαγγελισμός». Η έρευνα αφορά την χρονική περίοδο 1996- 2008. Τα ιστοτεμάχια επιλέχθησαν μετά από μικροσκοπική εξέταση των ιστολογικών χαρακτηριστικών του υλικού της μελέτης που έγινε από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση των πλακιδίων σε τομές ιστών των 5μ. Τα αντισώματα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην συγκεκριμένη μελέτη είναι τα εξής : Α.TGF-β1 (sc-52893, Santa Cruz Biotechnology, Inc) μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού σε αραίωση 1:50. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ιστολογικές τομές από θηλώδη καρκινώματα θυρεοειδούς. Β.HGFa (sc-7949, Santa Cruz Biotechnology, Inc) πολυκλονικό αντίσωμα κουνελιού σε αραίωση 1:150. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ιστολογικές τομές από χοληδόχο κύστη. Γ.Osteopontin (E-3284, Spring Bioscience) πολυκλονικό αντίσωμα κουνελιού σε αραίωση 1:100. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ιστολογικές τομές από αδενοκαρκινώματα μαστού. Δ.BMP-2/4 (BAF-355, R&D Systems) μονοκλονικό αντίσωμα αίγας σε αραίωση 1:150. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ιστολογικές τομές θηλωδών καρκινωμάτων θυρεοειδούς. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. Από τη μελέτη των στοιχείων που συλέχθησαν προέκυψε ότι από τις 54 περιπτώσεις οι 29 ποσοστό 53.7% ήταν άνδρες και 25 (46.3%) γυναίκες. Η ηλικία των ασθενών κυμαινόταν από 16 έως και 75 έτη με μέσο όρο τα 53.4 έτη. Η ηλικία διαχωρίστηκε σε δεκαετίες με την 2η-4η δεκαετία να αντιστοιχεί σε 9 ασθενείς ποσοστό 16.7%, την 5η σε 9 ασθενείς (16.7%), την 6η σε 17 (31.5%) και την 7η και πάνω 19 (35.2%). Η μελέτη περιελάμβανε: 19 αδενοκυστικά καρκινώματα από τα οποία 7 (13.0%) ήταν υψηλής κακοήθειας (high grade) και 12 (22.2%) μέσης κακοήθειας (intermediate grade). 13 βλεννοεπιδερμοειδή καρκινώματα, 2 (3.7%) υψηλής (high grade), 3 (5.6%) διάμεσης (intermediate grade) και 8 (14.8%) χαμηλής κακοήθειας (low grade) 5 (9.3%) πολύμορφα χαμηλού βαθμού κακοήθειας αδενοκαρκινώματα 2 (3.7%) αδενοκαρκινώματα NOS 1 (1.9%) καρκίνωμα των εκφορητικών πόρων των σιαλογόνων αδένων 3 (5.6%) βλεννώδη αδενοκαρκινώματα 1 (1.9%) καρκίνωμα από πολύμορφο αδένωμα 4 (7.4%) βασσικοκυτταρικά αδενοκαρκινώματα 6 (11.1%) μυοεπιθηλιακά καρκινώματα. Από πλευράς εντόπισης των βλαβών 31 (57.4%) βρίσκονταν στην υπερώα, 12 (22.2%) στην παρωτίδα, 3 (5.6%) στον υπογνάθιο αδένα , 1 (1.9%) στον υπογλώσσιο, 3 (5.6%) στο βλεννογόνο της παρειάς, 3 (5.6%) στην οπίσθια μοίρα της γλώσσας και τέλος 1 (1.9%) στο οπισθογόμφιο τρίγωνο. Όσον αφορά τη σταδιοποίηση των όγκων, με βάση το σύστημα ΤΝΜ, σε στάδιο Ι ταξινομήθηκαν 16 περιστατικά (29.6%), σε στάδιο ΙΙ 16 (29.6%), σε στάδιο ΙΙΙ 13 (24.1%) και τέλος σε στάδιο IVA 9 (16.7%). Η έκφραση του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού-β1(TGF-β1) αξιολογήθηκε ξεχωριστά για τα καρκινικά κύτταρα των όγκων των σιαλογόνων αδένων και για το υπόστρωμα Η έκφραση του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού (TGF-β1) σε κακοήθη νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων της παρούσας μελέτης ήταν ασθενής και εστιακή. Παρατηρήθηκε ασθενής θετική χρώση (+) σε ποσοστό 33.3% των κακοήθων όγκων (Πίνακας Α1). Στο υπόστρωμα ασθενής θετική χρώση (+) παρατηρήθηκε 37.0% των κακοήθων όγκων (Πίνακας Α2). Η συσχέτιση της έκφρασης του TGF- β1 των κακοήθων νεοπλασμάτων των σιαλογόνων αδένων με κλινικούς παράγοντες δεν έδειξε στατιστικά σημαντικές σχέσεις με το φύλο, την ηλικία και την εντόπιση. Στατιστικά σημαντική σχέση παρατηρήθηκε με τη σταδιοποίηση των κακοήθων όγκων p-value 0.039. Τα νεοπλάσματα σε στάδιο III και IVA φαίνεται να σχετίζονται με αυξημένη έκφραση TGF-β1 στο υπόστρωμα συγκριτικά με αντίστοιχα νεοπλάσματα σταδίου I, p-values = 0.062 και 0.074 αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε επίσης αυξημένη έκφραση της μορφογενετικής πρωτεΐνης οστού (ΒΜΡ-2) που εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των νεοπλασματικών κυττάρων. Στο σύνολο του δείγματος της μελέτης παρατηρήθηκε έντονα θετική χρώση (++) σε ποσοστό 3.7% των κακοήθων νεοπλασμάτων και ασθενώς θετική χρώση (+) σε ποσοστό 53.7%. Η μονοπαραγοντική άλλα και πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση δεν έδειξε σημαντική σχέση της έκφρασης της ΒΜΡ-2 με κλινικοπαθολογικούς παράγοντες ενώ θετική σχέση παρατηρήθηκε σχέση με τον ηπατοκυτταρικό αυξητικό παράγοντα (HGF-a). Η έκφραση του μορίου της οστεοποντίνης (OST) στην συγκεκριμένη μελέτη ήταν εστιακή και όχι σε όλη την έκταση των όγκων. Έντονα θετική έκφραση της χρώσης (+++) παρατηρήθηκε σε ποσοστό 9.25% των κακοήθων νεοπλασμάτων ενώ θετική έκφραση (++) παρατηρήθηκε σε ποσοστό 14.8%. Η εντόπιση των κακοήθων νεοπλασμάτων στην παρωτίδα συνδέεται με 8.56 περισσότερες πιθανότητες εντονότερης έκφρασης σε σχέση με την υπερώα και τέλος, αύξηση της ηλικίας κατά μια 10-ετία συνδέεται με 1.62 περισσότερες πιθανότητες εντονότερης έκφρασης της οστεοποντίνης (Πίνακας 4.6). Όσον αφορά τις συσχετίσεις του μορίου της οστεοποντίνης με τα υπόλοιπα βιολογικά μόρια δεν προκύπτει στατιστικά σημαντική σχέση. Η έκφραση του ηπατοκυτταρικού αυξητικού παράγοντα (HGFa) που παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη εντοπιζόταν στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών και μυοεπιθηλιακών κυττάρων των κακοήθων νεοπλασμάτων των σιαλογόνων αδένων και κάλυπτε μεγάλη έκταση των όγκων. Έντονα θετική έκφραση (++) παρατηρήθηκε σε ποσοστό 14.81% των κακοήθων νεοπλασμάτων ενώ ασθενώς θετική έκφραση (+) παρατηρήθηκε σε ποσοστό 68.51%. Η στατιστική ανάλυση έδειξε σημαντική σχέση με το φύλο των ασθενών και τη σταδιοποίηση των όγκων. Όσον αφορά στη συσχέτιση του HGFa με τα άλλα βιολογικά μόρια της μελέτης παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση με την μορφογενετική πρωτεΐνη οστών (BMP-2). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ. Παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των βιολογικών μορίων της μελέτης (TGF-β1, ΒΜΡ-2, OST, HGF-a) κυρίως στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων των κακοήθων νεοπλασμάτων των σιαλογόνων αδένων. Επίσης παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της έκφρασης του TGF-β1 σε σχέση με τη σταδιοποίηση των κακοήθων όγκων, της οστεοποντίνης με την ηλικία των ασθενών και την εντόπιση των νεοπλασμάτων, του ηπατοκυτταρικού αυξητικού παράγοντα (HGFa) με το φύλο και τη σταδιοποίηση των κακοήθων όγκων. Η στατιστικά σημαντική συσχέτιση της έκφρασης των βιολογικών μορίων της μελέτης με τους παραπάνω κλινικούς παράγοντες μπορεί να αποτελέσει τη βάση για περαιτέρω διερεύνηση της δράσης τους μέσω ποικίλλων μοριακών οδών