Correlation of mutations in the CFTR gene with atypical CF diseases

Cystic fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive disease in Caucasians. It is caused by defects in the CFTR gene which encodes the cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) protein. The aim of this study was to evaluate the frequency and nature of mutations in the CFTR gene in atypical CF diseases and specifically a) male infertility, in 53 males with congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD), 42 males with obstructive azoospermia without CBAVD and 75 males with severe oligozoospermia and b) chronic pulmonary diseases of unknown origin, in 53 patients with disseminated bronchiectasis,34 patients with asthma and 13 patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and compare the results to a group of 208 healthy subjects. The entire coding region of the CFTR gene was analyzed using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), for the detection of mutations and polymorphisms. The intron 8 poly-thymidine tract (IVS8-Tn) and the number of TG repeats in the same intron (IVS8-TGm) which determine the proportion of normal CFTR transcripts containing exon 9 and producing functional CFTR protein, were also analyzed. Additionally we studied the CFTR mRNA extracted from nasal epithelial cells in four splicing mutations (c.621+3A>G, c.711+3A>G, IVS8-5T, p.D565G) and one polymorphism (c.2752-15C/G).In the male infertility group a total of 36 different molecular defects were identified including five novel mutations (p.D565G, c.2790-8C/G, p.I521F, p.G817V, p.C491S) in 56 males. More specifically 62.3% (33/53) (p0.1) of males with oligozoospermia had at least one CFTR mutation, compared to 14.9% of the control subjects (31/208). In the chronic pulmonary group a total of 23 different molecular defects were identified including four novel mutations (p.T388M, p.M1R, p.V11I, p.Q378R) in 28 patients. More specifically 38.2% (13/34) (p0.1)) of patients with disseminated bronchiectasis had at least one CFTR mutation and 30.8% (4/13) (pG, c.711+3A>G and D565G lead to the production of aberrantly spliced CFTR transcripts. They cause reduction in the amount of normal CFTR mRNA and reduction in the amount of functional CFTR protein, so that they affect the phenotypic CF variability and modulate the disease severity.Η Κυστική Ίνωση αποτελεί το συχνότερο κληρονομικό νόσημα στη λευκή φυλή που κληρονομείται με τον υπολειπόμενο αυτοσωμικό χαρακτήρα. Προκαλείται από μεταλλάξεις στο CFTR γονίδιο που κωδικοποιεί την CFTR πρωτεΐνη (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η συσχέτιση των μοριακών διαταραχών της κυστικής ίνωσης με άτυπες κλινικές μορφές της νόσου και συγκεκριμένα α) την ανδρική υπογονιμότητα, σε 53 άρρενες με συγγενή αμφοτερόπλευρη έλλειψη σπερματικού πόρου (CBAVD), 42 άρρενες με αποφρακτική αζωοσπερμία χωρίς έλλειψη των σπερματικών πόρων και 75 άρρενες με σοβαρή ολιγοσπερμία και β) τις χρόνιες πνευμονοπάθειες αδιευκρίνιστης αιτιολογίας, σε 53 ασθενείς με διάχυτες βρογχιεκτασίες, 34 ασθενείς με άσθμα και 13 ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, και να συγκρίνει τα αποτελέσματα με τα αντίστοιχα από μια ομάδα 208 υγιών ατόμων. Έγινε ανάλυση όλων των κωδικοποιουσών περιοχών του CFTR γονιδίου, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα με κλίση αποδιατακτικού (DGGE), για την ανίχνευση μεταλλάξεων και πολυμορφισμών. Επίσης μελετήθηκαν η πολυθυμιδική αλληλουχία στο ιντρόνιο 8 (IVS8-Tn) και ο αριθμός των TG επαναλήψεων στο ίδιο ιντρόνιο (IVS8-TGm), τα οποία καθορίζουν το ποσοστό των φυσιολογικών CFTR μεταγράφων που περιέχουν το εξόνιο 9 και παράγουν λειτουργική CFTR πρωτεΐνη.Επιπροσθέτως έγινε ανάλυση των CFTR μεταγράφων (mRNA) σε συγκεκριμένες μοριακές διαταραχές που απαντούν χαρακτηριστικά στους ασθενείς με άτυπες κλινικές μορφές κυστικής ίνωσης, και συγκεκριμένα 4 μεταλλάξεις ματίσματος ( c.621+3A>G, c.711+3A>G, IVS8-5T, p.D565G) και 1 πολυμορφική θέση (c.2752-15C/G), χρησιμοποιώντας ως υλικό επιθηλιακά κύτταρα του ρινικού βλεννογόνου.Στους άνδρες με υπογονιμότητα ανευρέθησαν συνολικά 36 διαφορετικές μοριακές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένων πέντε νέων μεταλλάξεων (p.D565G, c.2790-8C/G, p.I521F, p.G817V και p.C491S) σε 56 άνδρες. Συγκεκριμένα στην ομάδα με CBAVD το ποσοστό των ανδρών με μία τουλάχιστον μοριακή διαταραχή στο γονίδιο της κυστικής ίνωσης ανέρχεται σε 62.3% (33/53) (p0.1), σε σύγκριση με την ομάδα των φυσιολογικών μαρτύρων όπου το αντίστοιχο ποσοστό ήταν 14.9% (31/208). Στους ασθενείς με χρόνια πνευμονοπάθεια ανευρέθησαν συνολικά 23 διαφορετικές μοριακές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένων τεσσάρων νέων μεταλλάξεων (p.T388M, p.M1R, p.V11I, p.Q378R) σε 28 ασθενείς. Συγκεκριμένα στην ομάδα με άσθμα το ποσοστό των ασθενών με μία τουλάχιστον μοριακή διαταραχή στο γονίδιο της κυστικής ίνωσης ανέρχεται σε 38.2% (13/34) (p0.1) και στην ομάδα με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια σε 30.8% (4/13) (pG, c.711+3A>G και p.D565G οδηγούν στην παραγωγή εναλλακτικών παθολογικών CFTR μεταγράφων. Προκαλούν μειωμένα ποσά φυσιολογικού CFTR mRNA και κατά συνέπεια μειωμένα ποσά λειτουργικής CFTR πρωτεΐνης, με τελικό αποτέλεσμα να επηρεάζουν ποικιλοτρόπως τον φαινότυπο των ασθενών και να τροποποιούν τη βαρύτητα της κυστικής ίνωσης