Molecular epidemiology of yersiniosis caused by Yersinia enterocolitica strains isolated from clinical specimens and food animals in Greece

Y. enterocolitica is widely distributed in nature in aquatic and animal reservoirs, with swine serving as a major reservoir for human pathogenic strains. Yersinia enterocolitica infections are a serious problem in countries around the Mediterranean sea, because of the high incidence of thalassemic syndromes. Iron overload and deferoxamine therapy in multitransfused children predisposes to systemic yersiniosis especially from strains O:3 and O:9 serotypes. Yersinia enterocolitica is responsible for 4% of human yersiniosis in general population in Greece. Not all Yersinia enterocolitica strains have the same pathogenicity. Virulence in Yersinia enterocolitica is a complex interplay between ecology, geographic distribution, biochemical and antigenic properties, chromosomal and plasmid encoded genes. Chromosomal virulence genes include yst, encoding a low-molecular weight heat-stable enterotoxin, which belongs to a family of structurally and functionally related enterotoxins produced by several species of diarrhogenic bacteria. Plasmid - encoded virulence factors such as yadA (Yersinia adhesin A) gene, are located on the pYV (plasmid for Yersinia virulence) plasmid and consist of a set of secreted proteins designated as Yops (Yersinia Outer Proteins) which are produced only above 30oC (usually 37oC). This temperature-dependent production of Yops is attended by severe growth restriction, and the process is mediated by the pYV-encoded transcriptional activator virF (for ‘’virulence’’) or lcrF (for ‘’low calcium response’’) for Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis, respectively. VirF (LcrF), the temperature-regulated activator of the yop regulon, also acts as an activator for yadA. The purpose of this study was to examine the distribution of pathogenic Yersinia strains in animal reservoirs (pigs, chickens, sheep, cows) from different Greek departments (Attica, Fthiotida, Viotia and Evia) and to characterize them with respect to the presence of chromosomal (yst) and plasmid-encoded virulence determinants (virF, yadA) so that we’ll be able to conclude the origin of the human pathogens carried by animal reservoirs. A total of 835 samples (tonsil and rectal swabs) were collected from an equal number of healthy, freshly slaughtered animals (pigs, chickens, cows and sheep) at slaughterhouses in Attica, Fthiotida, Viotia and Evia from November 1999 to April 2002. Ten Yersinia enterocolitica O:3/4 strains isolated from children with acute gastroenteritis in «Agia Sofia» hospital were also examined. Culture and isolation of Yersinia was performed with conventional bacteriological techniques. Identification of presumptive Yersinia colonies was performed by conventional bacteriological methods and by means of a commercially available identification system (BBL crystal; Becton Dickinson, Meylan, France). For the unambiguous identification of Yersinia enterocolitica within the genus, a 330-bp fragment of the 16S rRNA gene was detected by PCR amplification. .........................................................................Οι υερσίνιες εμφανίζουν επιδημιολογικό ενδιαφέρον λόγω της ευρείας διασποράς τους στo περιβάλλον, της δυνατότητας μετάδοσής τους στον άνθρωπο μέσω της τροφικής αλυσίδας και της μετάγγισης αίματος, αλλά και των σοβαρών λοιμώξεων που μπορούν να προκαλέσουν στις ευπαθείς ομάδες. Για τις Μεσογειακές χώρες όπως η Ελλάδα, οι υερσινιώσεις αποτελούν σοβαρό πρόβλημα λόγω της υψηλής επίπτωσης των θαλασσαιμικών συνδρόμων. Η υπερφόρτωση με σίδηρο και η θεραπεία αποσιδήρωσης με δεφερροξαμίνη (deferoxamine) στα πολυμεταγγιζόμενα παιδιά, προδιαθέτει τις συστηματικές υερσινιώσεις, ιδιαίτερα από στελέχη οροτύπων O:3 και O:9. H συχνότητα απομόνωσης των υερσινιών από κλινικά δείγματα και η ενοχοποίησή τους ως αιτιολογικών παραγόντων λοιμώξεων στον άνθρωπο, σύμφωνα με τα Ελληνικά βιβλιογραφικά δεδομένα, φθάνει το 4%. Τα παθογόνα στελέχη Yersinia enterocolitica φέρουν διάφορους χρωμοσωμικούς και πλασμιδιακούς παθογόνους παράγοντες. To χρωμοσωμικό γονίδιο yst κωδικοποιεί μία μικρού μοριακού βάρους θερμοανθεκτική εντεροτοξίνη της Y. enterocolitica που παράγουν μόνο τα εντεροδιεισδυτικά της στελέχη. Όλα τα παθογόνα στελέχη υερσινιών (Yersinia pestis, Yersinia pseudoturbeculosis και Yersinia enterocolitica) φέρουν πλασμίδιο μεγέθους περίπου 70-75 kb που ονομάζεται pYV (plasmid for Yersinia virulence). Στο πλασμίδιο αυτό οφείλεται η ικανότητα του βακτηρίου να ανθίσταται στη φυσική ανοσία και ειδικότερα στη φαγοκυττάρωση από τα μακροφάγα και τα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα (PMNs) και έτσι να επιβιώνει και να πολλαπλασιάζεται στο λεμφικό ιστό (τροπισμός για το λεμφικό ιστό). Το yadA (Yersinia adhesin A) εντοπίζεται στο πλασμίδιο. Η έκφραση του yadA γονιδίου ρυθμίζεται από το VirF (ή LcrF για τη Yersinia pseudotuberculosis) γονίδιο και εκφράζεται μόνο στους 37?C. Σκοποί της παρούσας διατριβής είναι να διερευνηθεί με επιδημιολογικούς δείκτες (οροτυπία, βιοτυπία, αντιβιόγραμμα, γονοτυπία) η διασπορά παθογόνων για τον άνθρωπο στελεχών υερσίνιας, στις ζωϊκές παρακαταθήκες στην Ελλάδα και να εξαχθούν συμπεράσματα για την προέλευση των παθογόνων υερσινιών, που ευθύνονται για νόσο στον άνθρωπο. Συλλέχθηκαν συνολικά 835 φαρυγγικά και ορθικά επιχρίσματα από ισάριθμα βρώσιμα ζώα (χοίρους, βοοειδή, αρνιά και όρνιθες). Η δειγματοληψία έγινε από το Νοέμβριο του 1999 έως τον Απρίλιο του 2002 σε σφαγεία, στάβλους και ορνιθοτροφεία της Ανατολικής Στερεάς Ελλάδας (νομοί Αττικής, Φθιώτιδας, Βοιωτίας και Εύβοιας). Μελετήθηκαν επίσης δέκα στελέχη Υersinia enterocolitica O:3/4 που απομονώθηκαν από παιδιά που έπασχαν από γαστρεντερίτιδα στο Νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία». Τα δείγματα καλλιεργήθηκαν σε εκλεκτικά θρεπτικά υλικά ενώ για την απομόνωση υερσινιών χρησιμοποιήθηκε η τεχνική του ψυχροεμπλουτισμού σε συνδυασμό με την κατεργασία των δειγμάτων με άλκαλι. Οι μορφολογικά ύποπτες αποικίες ταυτοποιήθηκαν με προκαταρκτικές βιοχημικές δοκιμασίες και ημιαυτόματα συστήματα ταυτοποίησης όπως το API 32E (Biomerieux) και το BBL Crystal (Becton Dickinson). Για την αναμφισβήτητη ταυτοποίηση του είδους Υersinia enterocolitica έγινε επίσης ανίχνευση του γονιδίου 16S rRNA 330 bp, με τη μέθοδο της PCR. .........................................................................................................................................................