Proteomic analysis of inducible cell systems Saos2-p21 and U2OS-E2F1

Proteomics is the science concerning the study of proteins. Proteome is the sum of proteins present in an organism, cell, organelle even body fluid, that is determined quantitatively at a certain moment and under precisely defined limiting conditions. Usually, the applied technique in proteomics is two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE). Using the above technique we can separate as many as 2000 proteins in one run. In this way we can compare the proteomes of control and pathologic samples, to find differences, to better understand diseases, like cancer, and to reveal potential molecular biomarkers. We applied 2DE for the proteomic analysis of the inducible cancer cell systems U2OS ER-E2F1 and Saos2 p21-Tet On. These cancer cell lines derived from patient’s osteosarcoma and are genetically modified so we can control the expression of E2F1 and p21. E2F1 is a transcription factor, whose main function is the promotion of cell cycle from G1 phase to S phase. When is released from his inhibitor, the retinoblastoma protein pRb, during mid G1 phase, E2F1 promotes the transcription of genes necessary for the entrance of the cell to S phase. Beyond this role, E2F1 can promote apoptosis through p53-dependent and p53-independent pathways, when excess damage is present in the cell. To understand the double role of E2F1 we studied the molecular changes of U2OS cells before and after its induction. p21Cip1 is an inhibitor of cycle-dependent kinases and its expression is p53-dependent and p53-independent. The primal role of p21 is inhibition of cell cycle through G1, S and G2 phases. Additionally p21 is implicated in differentiation, cellular senescence and apoptosis. Due to these multiple functions of p21 we studied the molecular changes in Saos2 cells after its induction. For more accurate results we applied proteomic analysis in the parental cell lines U2OS and Saos2. Comparison of proteomes before and after the induction of the genes, E2F1 for U2OS ER-E2F1 and p21 for Saos2 p21-Tet On, as well as those of the parental cell lines, we found differences concerning the hole response of the cell to overexpression of the above genes. Overexpression of p21 in Saos2 cells concequences to induction of 70 proteins and suppression of 25 proteins. Those proteins belong to several functional groups. Some of the most important groups are the group of 14-3-3 proteins, cytoskeletal proteins, proteins implicated in translation/transcription of DNA, metabolism, immunology, adherent proteins and transcription factors. Respectively, activation of E2F1 in U2OS cells led to induction of 52 proteins and suppression of 23 proteins. Consequently, we applied bioinformatic analysis using the Pathway Studio (AriadneGenomics) program and we created molecular networks. Some of the differentially expressed proteins seem to regulate the expression of p53 and ATM. Concluding, proteomic analysis helps in better understanding the cellular function, since it provides a more holistic view of the molecular changes that occur in it. Proteomics is a linkage between the genome and its expression. Application of proteomics in the inducible cell systems Saos2 p21-Tet On and U2OS ER-E2F1 revealed a number of proteins to be affected by p21 and E2F1, respectively in osteosarcoma cells. Finally, those proteins could be potential molecular biomarkers for osteosarcoma and can aid in comprehension of p21 and E2F1 function in cells.Πρωτεωμική είναι η επιστήμη που ασχολείται με τη μελέτη των πρωτεϊνών. Έτσι, πρωτέωμα χαρακτηρίζεται το σύνολο των πρωτεϊνών ενός οργανισμού, κυττάρου, οργανιδίου ακόμα και σωματικού υγρού, που προσδιορίζεται ποσοτικά μια δεδομένη στιγμή και κάτω από αυστηρά καθορισμένες συνθήκες. Για τη μελέτη των πρωτεϊνών αυτών ακολουθείται συνήθως μια τεχνική που ονομάζεται δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης (two-dimensional electrophoresis polyacrylamide gel, 2DE). Με την παραπάνω τεχνική μπορούν να διαχωριστούν μέχρι και 2000 πρωτεΐνες σε μια μόνο εφαρμογή. Με αυτό τον τρόπο μπορούν να συγκριθούν τα πρωτεώματα φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων και να βρεθούν διαφορές μεταξύ τους, οδηγώντας στην καλύτερη κατανόηση των διαφόρων ασθενειών, όπως είναι ο καρκίνος, αλλά και στην εύρεση πιθανών μοριακών δεικτών. Εφαρμόσαμε την παραπάνω μέθοδο για την πρωτεωμική ανάλυση των επαγώγιμων καρκινικών κυτταρικών συστημάτων U2OS ER-E2F1 και Saos2 p21-Tet On. Οι κυτταρικές αυτές σειρές προέρχονται από οστεοσάρκωμα ασθενών και έχουν τροποποιηθεί γενετικά έτσι ώστε να ελέγχεται η έκφραση των γονιδίων E2F1 και p21 αντίστοιχα. Το μόριο E2F1 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας με κύρια δράση του την προαγωγή του κυτταρικού κύκλου από τη G1 φάση στην S. Απελευθερώνεται από τον αναστολέα του, την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος pRb, στα μέσα της G1 φάσης, όπου ελεύθερος πια ενεργοποιεί τη μεταγραφή γονιδίων απαραίτητων για την είσοδο των κυττάρων στην S φάση. Πέρα από το ρόλο αυτό, ο E2F1 οδηγεί τα κύτταρα σε απόπτωση μέσω p53-εξαρτώμενων και p53-ανεξάρτητων μονοπατιών, όταν υπάρχουν τεταμένες βλάβες σε αυτό. Λόγω του διττού ρόλου του μελετήθηκε η επίδρασή του στο μοριακό υπόβαθρο των U2OS κυττάρων έπειτα από επαγωγή του. Η πρωτεΐνη p21Cip1 είναι αναστολέας των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών και η έκφρασή του ρυθμίζεται από p53-εξαρτώμενα και p53-ανεξάρτητα μονοπάτια. Βασικός ρόλος της p21 είναι η αναστολή του κυτταρικού κύκλου στις G1, S και G2 φάσεις. Επιπλέον η p21 εμπλέκεται στη διαδικασία διαφοροποίησης των κυττάρων, στην κυτταρική γήρανση καθώς και στην απόπτωση αυτών. Λόγω των πολλαπλών αυτών ρόλων της p21 μελετήθηκαν οι μοριακές αλλαγές που υφίστανται τα Saos2 κύτταρα ύστερα από επαγωγή της. Τέλος για την πιο αξιόπιστη μελέτη των διαφορών που οφείλονται στην επαγωγή και μόνο των μορίων E2F1 και p21 μελετήθηκαν και τα πρωτεώματα των πατρικών καρκινικών κυτταρικών σειρών U2OS και Saos2. Συγκρίνοντας τα πρωτεώματα των κυττάρων πριν και μετά την επαγωγή των γονιδίων, E2F1 για τα U2OS ER-E2F1 και p21 για τα Saos2 p21-Tet On, καθώς και αυτά των πατρικών κυτταρικών σειρών, βρέθηκαν διαφορές οι οποίες οφείλονται στη συνολική απόκριση των κυττάρων στην υπερέκφραση των παραπάνω γονιδίων. Υπερέκφραση της p21 στα Saos2 κύτταρα οδήγησε στην επαγωγή 70 πρωτεϊνών και στη καταστολή 24. Οι πρωτεΐνες αυτές ανήκουν σε διάφορες λειτουργικές ομάδες. Οι πιο σημαντικές από αυτές είναι η ομάδα των 14-3-3 πρωτεϊνών, πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού, του μονοπατιού της ουμπικουϊτίνης, πρωτεΐνες σχετιζόμενες με τη μεταγραφή/μετάφραση του DNA, το μεταβολισμό, την ανοσολογία και την προσκόλληση των κυττάρων καθώς και μεταγραφικοί παράγοντες. Αντίστοιχα, ενεργοποίηση του E2F1 στα U2OS κύτταρα οδήγησε στην επαγωγή 52 πρωτεϊνών και στη καταστολή 23 πρωτεϊνών. Στη συνέχεια οι πρωτεΐνες αυτές επεξεργάστηκαν με βιοπληροφορική μελέτη χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Pathway Studio (AriadneGenomics). Έτσι δημιουργήθηκαν μοριακά μονοπάτια που δείχνουν την επίδραση κάποιων από τις πρωτεΐνες που άλλαξαν έκφραση στη λειτουργία του p53 και του ATM. Συμπεραίνοντας, η πρωτεωμική ανάλυση βοηθά στην καλύτερη κατανόηση της λειτουργίας των κυττάρων, αφού παρέχει μια πιο ολική άποψη των μοριακών γεγονότων που συμβαίνουν σε αυτό καθώς συνδέει την πληροφορία που υπάρχει στο γονιδίωμα του κυττάρου με το τελικό αποτέλεσμα της έκφρασης αυτού. Η εφαρμογή της πρωτεωμικής στα επαγώγιμα κυτταρικά συστήματα Saos2 p21-Tet On και U2OS ER-E2F1, είχε σαν αποτέλεσμα την ανάδειξη πρωτεϊνών που επηρεάζονται από την επίδραση των μορίων p21 και E2F1, αντίστοιχα στα κύτταρα του οστεοσαρκώματος. Τέλος οι πρωτεΐνες που είδαμε ότι αλλάζουν έκφραση μπορούν να αποτελέσουν πιθανούς βιολογικούς δείκτες για την καταπολέμηση του καρκίνου των οστών, όπως και να μας βοηθήσουν στην καλύτερη κατανόηση της λειτουργίας των p21 και E2F1 στα κύτταρα