Contribution of hemopoietic cell culture techniques to the study of pathogenesis, diagnosis and therapy of myeloproliferative disorders

BACKGROUND & AIMS Haematopoietic progenitors from PV patients are characterized by decreased apoptosis, increased kinase activity, hypersensitivity to haematopoietic cytokines and reduced responsiveness to negative signals from marrow microenviroment, while there are no analogous data for the ET progenitors. Endogenous erythroid colony formation (EEC) is a specific feature of myeloploliferative disorders (MPD) which is found in the vast majority of PV cases but only in 50-85% of patients suffering from ET. In the present study we have addressed the hypothesis that EEC defines a subgroup of ET patients with different functional features of haemopoietic progenitors. METHODS Mononuclear cells and MACS selected CD34+ cells from bone marrow samples of 8 normal donors, 10 PV and 17 ET patients, all of them untreated, were subjected in short and long term cultures in methylcellulose with or without serum or cytokines. Fas receptor, a central pathway of cell apoptosis and c-kit receptor are both implicated in the regulation of survival and proliferation of haematopoietic progenitors. The surface expression of c-kit and Fas on PV and ET CD34+ cells was assessed by flow cytometry and was correlated with their clonogenic potential. The role of marrow stroma was addressed by plating normal CD34+ progenitors for LTC-IC assays in irradiated stroma-layers estab­lished by EEC (+) and EEC (-) MPD. RESULTS 1. Short term cultures in semisolid media: The colonogenic output of total bone marrow cells in the presence or not of serum was not statistically significant different among MPD patients and the normal donors, while EEC formation was noticed in 9 out of 10 PV patients (percentage 90%) and in 6/17 ET patients tested (percentage 37%) 2. CFC potent ional of MPD CD34+ haemopoietic progenitors in semisolid media with cytokines: EEC is reproduced in 4/10 (percentage 40%) of PV positive patients and in 2/6 (percentage 33%) of ET patients from this selected haemopoietic progenitor population. The CFC output of PV CD34+ cells was higher than the ET ones irrespective of EEC (CFC ND= 93±25.3, CFC PV= 106.9±24.7, CFC ET= 75±29.8 p= 0.047, CFC ETa= 35±8.7 p= 0.037). 3. CD34+ haemopoietic progenitors cells showed increased Fas expression on MPD CD34+ but escape from its negative effect on colony forming capacity: In selected CD34 population from normal donors, CFC and BFU-E formation was strongly related to the levels of surface Fas expression (ρ of Spearman= -0.833 for CFC and ρ= -0.820 for BFU-E). Fas was overexpressed in all MPD CD34+ cells, irrespective of the phenotype (ND= 7.62%±1,86, PV= 27.29%±6.78 p= 0.004, ET= 30.41%±8 p= 0.003, ETa= 21.17%±7.84 p= 0.016) and showed no correlation with the total or erythroid colony forming capacity. Similarly, c-kit expression was equally high in all groups and was not correlated to the clonogenic output. 4. Long Term Bone Marrow Cultures (LTBMC) discriminates on a functional level the EEC (+) and EEC (-) ET: Considering the colony forming ability per 1x105 non-adherent cells, more colonies were produced especially after week three for both PV and ETa samples comparing to ET ones. (PV= 45,36±6,2 on wk 3 and 26,55±4,38 on wk 4, ET= 19,50±5,51 on wk 3 and 10,2±3,81 on wk 4 , p=0,008 and p=0,004 respectively ETα= 45,33± 13,76 on wk 3 and 34,50±12,25 on wk 4 p= 0,044 and p= 0,044 respectively) The mean total clonogenic output during the four week period of the LTBMC, was statistically significant higher in PV (Total CFC= 1649±245.23) and EEC positive ET (Total CFC= 1520±332), than in ND= 816.47±287.57 (p= 0.035 PV vs ND). EEC formation was continuesly diminished, reproduced by 4/15 positive samples till the fourth week of the long term culture, and it was reproduced in only 1/15 EEC positive patients from the fraction of the adherent cell. The total CFC ability of them is higher in all MPD samples com­paring to normal donors (PV= 640,18±169,27, ET= 660,3±168,72, ETα= 759,83±239 and ND= 251,5±68,82 p= 0,05 PV vs ND, p= 0,045 ETa vs ND, p= 0,044 ET vs ND, t-test) but this feature is disappearing in the presence of cytokines, showing altered respon­siveness to them rather than diminished frequency of haemopoietic progenitors. 5. CD34+ selected haemopoietic progenitors cells from normal donors, they don’t get different signals from stroma cells of EEC+ or EEC- MPD’s and their clonogenic output in a five week lasting LTBMC is the same. CONCLUSIONS Haematopoietic progenitors from EECpos ET displayed higher clonogenic activity in LTBMC compared to the EECneg ET ones and resembles those developed from PV patients. This property was not attributed to a marrow stroma effect neither to an intrinsic proliferative advantage of CD34+ cells but rather to enhanced responsiveness of hematopoietic progenitors to signals from the bone marrow microen­viroment. Both Fas and c-Kit were equally expressed on the surface of CD34+ progenitors of all MPD’s and was not correlated with their clonogenic capacity in contrast to the negative correlation between Fas and clonogenic output observed in ND.ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα από ασθενείς με αληθή πο­λυκυτ­ταραιμία (ΑΠ) χαρακτηρίζονται από ελαττωμένη απόπτωση, αυξη­μένη φωσφορυλίωση μέσω δράσης τυροσινικής κινάσης και ειδικότερα της μεταλλαγμένης κινάσης JAK2 (V617F), η οποία εμπλέκεται στην ενδο­κυττάρια οδό διαβίβασης του σήματος από πολλούς κυττοκινικούς υποδο­χείς, υπερευαισθησία σε κυτταροκίνες και ελαττωμένη ανταπόκριση σε αρνητικά ρυθμιστικά σήματα από το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών. Η ανάπτυξη αποικιών της ερυθράς ανεξάρτητων της ερυθρο­ποιη­τίνης (ΑΑΕ) είναι ειδικό γνώριμα των μυελοϋπερπλαστικών νοσημάτων (ΜΥΝ), που απαντάται στην πλειονότητα των ασθενών με ΑΠ αλλά μόνο στο 50-85% αυτών που πάσχουν από ιδιοπαθή θρομβοκυθαιμία (ΙΘ). Στην παρούσα μελέτη μελετήσαμε τις ιδιότητες των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων από ασθενείς με ΜΥΝ σε διαφορετικά επίπεδα ωρίμανσης και δέσμευσης, την επίδραση κυτταροκινών σε αυτά, όπως και τον πιθανό ρόλο των στρωματικών κυττάρων. Επιπλέον μελετήσαμε την επίδραση δύο υποδοχέων, του Fas και του c-Kit, που είναι σημαντικοί υποδοχείς για την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την επικοινωνία των κυττάρων με το μικροπεριβάλλον. Υποθέτουμε ότι η ΑΑΕ μπορεί να ορίσει μέσα στο ετερογενές φάσμα της ΙΘ μια υποκατηγορία ασθενών με διαφορετική βιολογία και πρόγνωση. ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ Λεμφομονοπύρηνα κύταρα και CD34 επιλεγμένα με ανοσομαγνη­τικό διαχωρισμό, αιμοποιητικα προγονικά κύτταρα, από τον μυελό των οστών από 8 υγιείς δότες, 10 ασθενείς με ΑΠ και 17 με ΙΘ, εκ των οποίων οι 6 είχαν θετική ΑΑΕ (ΙΘα), υποβλήθηκαν σε καλλιέργειες βραχείας διάρκειας παρουσία ή όχι κυτοκινών ή ορού και σε καλλιέργειες μακράς διάρκειας. Η έκφραση επιφανείας των υποδοχέων Fas και c-Kit στα επι­λεγμένα CD34 προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα ελέγχθηκε με κυτταρο­με­τρία ροής. Ο ρόλος του στρώματος μελετήθηκε με την ανάπτυξη μικτών καλλιεργειών από ακτινοβολημένα στρωματικά κύτταρα από ασθενείς με ΜΥΝ ΑΑΕ+ ή ΑΑΕ- και επιλεγμένα CD34 προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα από υγιής δότες. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Καλλιέργειες βραχείας διάρκειας: Το ολικό κλωνογόνο δυναμικό ολικών μονοπύρηνων κυττάρων μυε­λού των οστών και στις τρεις υποομάδες ΜΥΝ και στους υγιής δό­τες, δεν διέφερε σημαντικά. ΑΑΕ παρατηρήθηκε σε 9 από τους 10 ασθενείς με ΑΠ (90%) και σε 6 από τους 17 με ΙΘ (37%). 2. Το κλωνογόνο δυναμικό των CD34+ αιμοποιητικών προγονικών κυτ­τά­ρων σε ημιστέρεα μέσα παρουσία κυτοκινών, είναι ελαττω­μένο στα προγονικά της ΙΘ σε σχέση με αυτά της ΑΠ: ΑΑΕ περατη­ρήθηκε σε 4/10 (40%) ασθενείς με ΑΠ και 2/6 (33%) με ΙΘ. Το κλωνογόνο δυναμικό σε αυτό το επιλεγμένο κλάσμα προγονικών κυττάρων, ήταν σημαντικά μεγαλύτερο στους ασθενείς με ΑΠ σε σχέση με αυτών με ΙΘ ανεξαρτήτως της ιδιότητας της ΑΑΕ. (ΑΠ= 106,90±24,7, ΙΘα= 34,88±8,7, ΙΘ= 76,00,±20,8 και p= 0,037 ΑΠ vs ΙΘα και p= 0,047 ΑΠ vs ΙΘ) 3. Τα CD34 προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη έκφραση Fas επιφανείας στα ΜΥΝ και διαφυγή από την αρνητική ρυθμιστική του δράση: Σε προγονικά αιμοποιητικά κύταρα από υγιής δότες τόσο οι ολικές CFC όσο και οι ερυθρές αποικίες BFU-E σχετίζονται με ισχυρή αρνη­τική συσχέτιση με την έκφραση του υποδοχέα Fas. Η έκφραση επιφανείας του Fas σχετίζεται με την ανάπτυξη των ολικών αποι­κιών (ρ= -0,833) και των αποικιών της ερυθράς σειράς (ρ= -0,820). Ο υποδοχέας Fas υπερεκφράζεται στα CD34 σε όλες τις υποομάδες των ΜΥΝ και χάνεται η συσχέτιση του τόσο με την απόδοση ολι­κών αποικιών, όσο και με αυτήν των ερυθρών (27,29±6,79% στην ΑΠ, 30,41±8% στην ΙΘ χωρίς ΑΑΕ, 21,17±7,84% στην ΙΘ με ΑΑΕ και 7,63±1,86% στην ΟΕ, p= 0,004 στην ΑΠ, p= 0,003 στην ΙΘ, p= 0,016 στην ΙΘα σε σχέση με την ΟΕ). Ο υποδοχέας c-kit εκφράζεται σε ίδια υψηλά επίπεδα στα CD34 από ασθενείς με ΜΥΝ και υγιής δότες και δεν σχετίζεται με το κλωνογόνο δυναμικό. 4. Οι καλλιέργειες μακράς διάρκειας (LTBMC) διαχωρίζουν δύο δια­φο­ρετικούς τύπους ανάπτυξης στα ΜΥΝ με + ΑΑΕκαι -ΑΑΕ: Το κλωνογόνο δυναμικό από 1x105 μη προσκολλημένα κυτταρα, ιδίως από την τρίτη εβδομάδα και μετέπειτα της καλλιέργειας, είναι σημαντικά υψηλότερο στην ΑΠ και Ιθα σε σχέση με την ΙΘ (ΑΠ= 45,36±19,58 την 3η και 26,55±13,87 την 4η και ΙΘ= 19,50±16,54 την 3η και 10,2±11,56 την 4η , p=0,008 και p=0,004 αντίστοιχα και ΙΘα= 45,33±30,77 την 3η και 34,50±27,39 την 4η p=0,044 και p=,0044 αντίστοιχα), αλλά και η μέση τιμή των συνολικών αποικιών από τα μη-προσκολλημένα κύτταρα στις 4 εβδομάδες της καλλιέργειας μα­κράς διάρκειας, ήταν σημαντικά υψηλότερο στην ΑΠ και στην ΙΘα σε σχέση με την ΟΕ. Συγκεκριμένα: ΑΠ= 1649,43±245,23, ΟΕ= 816,47±287,57, ΙΘα= 1520,46±332 ΙΘ= 971,85±257,2 ενώ p=0,035 στην σύγκριση ΑΠ με ΟΕ και p=0,046 ΙΘα με ΟΕ...