Experimental model of epilepsy in young rats: the role of endogenous nitric oxide

The aim of the present study is to examine the implication of NO in an experimental model of prolonged seizures in young rats, at the substrate of perinatal hypoxia-included seizures. The implication of NO is evaluated indirectly, by examining the effect of inhibition of seizures-mediated NO production. For this study, 7-Nitroindazole, a selective inhibitor of neuronal synthase of NO was used. According to the experimental protocol, rat pups on postnatal day 10-11 were exposed to conditions of hypoxia by decreasing O2 concentration, from 7% to 4% within 15 minutes. Only animals that had more five tonic-clonic seizures during the period of hypoxia were included in the study. On postnatal day 21-22 (P21-22), these rats were administered with kainic acid (KA) (10mg.kg i.p.) in order to induce prolonged seizures. A group of animals were pretreated with 7-Nitroindazole(7-NI), 30 minutes before KA. The study of concluded clinical evaluation of prolonged seizures, histological assessment of neurodegeneration with H-E evaluation of mossy fiber sprouting with Timm's staining, methods of immunohistochemistry for assessment of apoptotic cell death pathway function in the wake of prolonged seizures, was studied, at 4, 24, 48, 72 and 96 hours by examined activation of apoptotic markers, Bax and caspase-3 as well as expression of NF-kB(nuclear factor-kB) in rat hippocampus. Besides, activation of astrocytes was examined with GFAP staining, as reactive astrocytes are reported to be involved in pathology of seizures and inhibition of neuronal synthetase of NO (nNOS) by 7-Nitroindazole was evaluated with immunohistological methods. Finally, behavioral tests were conducted in order to evaluate seizures-induced long-term consequences in spatial learning and memory later in life and to clarify the role of NO. Behavioral tests consisted of open field maze, passive and active avoidance test and water maze. According to the results, inhibition of NO production of neuronal origin does not seem to influence behavioural seizures under the circumstances of acute phase of SE, although it is indicated to diminish seizure-induced neuronal damage and lead to neuroprotection. Neuroprotection is accomplished by inhibition of necrotic and not apoptotic procedure for neurons. However, inhibition of NO production seems to induce expression of apoptotic markers in astrocytes 96 after status epilepticus, consisting a possible protective mechanism against harmful consequences of astrogliosis after seizures. Inhibition of NO did not affect significantly neurofunctional disturbances, observed in the process of epileptogenesis, even though it reduced mossy fiber sprouting in CA3 region of hippocampus, resulting probably to reduction of synaptic reorganization of hippocampus after seizures. The above changes of synaptic plasticity may neither attenuate nor aggravate seizure-induced neurological disturbances. On the other side, synaptic reorganization seizure susceptibility and inhibition of seizure-mediate NO production seems to eliminate it, as evidenced by spontaneous recurrent seizures observed only in the KA group.Η παρούσα διδακτορική διατριβή σκοπό έχει τη διερεύνηση του ρόλου του ΝΟ στην επιληψία πειραματοζώων κατά τα πρώτα στάδια της ζωής και ειδικότερα στους παρατεινόμενους σπασμούς που παρατηρούνται σε υπόστρωμα υποξικών νεογνικών σπασμών. Στο πειραματικό μοντέλο που εφαρμόσθηκε, επίμυες ηλικίας 10 ημερών εκτίθενται σε υποξικές συνθήκες με σταδιακή μείωση της συγκέντρωσης του οξυγόνου από 7% σε 4%, για 15 λεπτά. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν ζώα που παρουσίασαν περισσότερους από 5 τονικοκλονικούς σπασμούς κατά τη διάρκεια της υποξίας. Στους ίδιους επίμυες, σε ηλικία 21 ημερών, προκλήθηκε επεισόδιο παρατεινόμενης επιληπτικής κρίσης (status epileptcus-SE), με τη χορήγηση καϊνικού οξέος (ΚΑ) (10mg/kg, ενδοπεριτοναϊκά). Για τη μελέτη του ρόλου του ΝΟ, σε μία ομάδα πειραματοζώων, 30 λεπτά πριν την χορήγηση του ΚΑ, χορηγήθηκε 7-Νιτροϊνδαζόλη (50mg/kg), που είναι εκλεκτικός αναστολέας της νευρωνικής συνθάσης του ΝΟ (nNOs). Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη περιελάμβαναν την κλινική αξιολόγηση των επιληπτικών κρίσεων, δοκιμασίες συμπεριφοράς (ανοιχτού και υδάτινου λαβύρινθου, δοκιμασίες παθητικής και ενεργητικής αποφυγής) και ιστολογική και ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση της νευροεκφύλισης (4, 24, 48, 72, 96 ώρες) και των βρυωδών εκβλαστήσεων (50 ημέρες μετά το SE). Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης, η αναστολή της παραγωγής του ΝΟ από τους νευρώνες δεν φαίνεται να επηρεάζει την κλινική εικόνα των πειραματοζώων κατά την οξεία φάση του SE, ωστόσο φαίνεται να ασκεί νευροπροστατευτική δράση καθώς μειώνει το ποσοστό του νευρωνικού θανάτου. Η δράση αυτή ασκείται μέσω της αναστολής της νεκρωτικής αλλά όχι της αποπτωτικής διαδικασίας για τους νευρώνες, ενώ στα αστροκύτταρα 96 ώρες μετά το SE, η αναστολή της παραγωγής του ΝΟ φάνηκε να προκαλεί έκφραση δεικτών αποπτωτικού θανάτου. Πιθανόν αυτός να είναι ένας μηχανισμός προστασίας από τις αρνητικές συνέπειες της αστροκυττάρωσης μετά από επιληπτικές κρίσεις. Παράλληλα, η ανατολή του ΝΟ δεν επέδρασε σημαντικά στην έκπτωση των ανώτερων φλοιϊκών λειτουργιών που παρατηρούνται λόγω της επιληπτογένεσης, αν και μείωσε το ποσοστό των εκβλαστήσεων των βρυωδών ινών της CA3 περιοχής του ιπποκάμπου. Οι μεταβολές αυτές στην πλαστικότητα των συνάψεων και τη συναπτική αναδιοργάνωση, ωστόσο, δε φαίνεται να έχει έμμεση συσχέτιση με την επίδοση των πειραματοζώων στις δοκιμασίες συμπεριφοράς. Το γεγονός όμως ότι η αναδιοργάνωση των συνάψεων μετά από επιληπτικές κρίσεις καθιστά τον εγκέφαλο πιο ευάλωτο στην εμφάνιση νέων επιληπτικών κρίσεων, φαίνεται να περιορίζεται με την αναστολή του ΝΟ. Η κλινική εκδήλωση αυτής της παρατήρησης ήταν η εμφάνιση υποτροπιαζουσών επιληπτικών κρίσεων στην ομάδα του ΚΑ κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης τους μέχρι την ηλικία των 70 ημερών