Phytochemical analysis of Sorbus domestica (Rosaceae) fruits and assessment of their antioxidant capacity and aldose reductase inhibition potential

Sorbus domestica (Rosaceae) fruits are empirically used in many regions of Europe as antioxidants in drinks and beverages and in traditional medicine as hypoglycaemic agents and as remedy against the long term diabetic complications. However, there were not any scientific references concerning these activities. In the present research work fruit extracts were tested about their phenolic content, the antioxidant potential (DPPH· and luminol chemiluminescence tests) and their ability to inhibit the aldose reductase enzyme (ALR2). This enzyme is postulated to be associated with the development of the long term diabetic complications, where also cellular oxidative stress is implied. For all these purposes five different fruit types were tested for comparison reasons: (A) unripe fruits, (B) fruits well matured on tree, (C) fruits collected unripe and left for maturation for one week at room temperature, (D) fruits collected unripe and left for maturation for three weeks at room temperature & (E) vacuum-packed pulp from unripe fruits. Only categories (D) and (E) are used as traditional remedy, thus the comparative study is important. The qualitative and quantitative phytochemical analysis of the initial extracts was realized at an LC-DAD-MS (ESI+) system, were structure elucidation was achieved by the fragmentation mechanism. Furthermore, in cases where structure elucidation was not possible with this system, compounds were isolated and clarified also with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and High Resolution MS/MS spectra. Preparative techniques, such as Column Chromatography (CC), High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) and Thin Layer Chromatography (TLC), were applied for the isolation of the compounds. Phytochemical analysis resulted to the elucidation of eighty compounds that belong to the categories of hydroxybenzoic acids, hydroxyphenylpropanoid acids and derivatives, flavonoids and biphenyls. Among these compounds twenty were new structures: six quercetin dimmers, two kaempferol dimmers, two new quercetin glycosides, a quercetin sorbyl-hexoside, a hexosylated 3-O-quercetin ester, a 7-O- acacetin feruloyl ester, a 7-O-hexosylated 3’,6’,5,7-tetrahydroxyflavanol, a trimeric vanillic acid derivative, a protocatechuic acid anhydrite, a complex polyphenolic phenylpropanoid, two biphenyls and an octahydroanthracene derivative. Furthermore an unsaturated tridlyceride was isolated and its structure was partially confirmed only with NMR spectra. All fruit categories were rich in quinic acid phenylpropanoid esters. Unripe categories (A) and (C) and fruit pulp (E) are rich in flavonoids and relatively poor in hydrobenzoic acids, while the opposite stands for the well matured categories (B) and (D), where, according to the quantitative analysis, these fruits are rich in hydrobenzoic acids. Biphenyls were isolated only from fruits well matured on tree and, according to literature, such structures are phytoalexins with antimicrobial function. The antioxidant potential of different extracts was evaluated by the use of two techniques and fruit categories (A) and (C) (unripe), as well as fruit pulp (E) showed strong antioxidant capacity. On the other hand, well matured categories (B) and (D) were comparatively weaker antioxidants. These results correlate with the phenolic content, since flavonoids are stronger antioxidants than phenolic acids. Concerning the evaluation of the extracts’ capacity to inhibit the enzyme aldose reductase, all fruit categories showed a similar potential. All fruits’ diethyl ether and ethyl acetate extracts strongly inhibited the enzyme. Previous studies have proven that compounds that belong to the categories of flavonoids and quinic acid phenylpropanoid esters generally inhibit in vitro the enzyme aldose reductase. Thus, this capacity of the extracts seems that straightly relates with compounds in the extracts, with the exception of the biphenyls, which were tested after isolation and did not show effective aldose reductase inhibition capacity. This research work is the first phytochemical study of the phenolic content of Sorbus domestica fruits, as well as the first scientific establishment that fruits could act at the same time as antioxidants and inhibitors of the long term diabetic complications.Ο καρπός του φυτού Sorbus domestica (Rosaceae) χρησιμοποιείται εμπειρικά σε πολλές περιοχές της Ευρώπης σαν αντιοξειδωτικός παράγοντας σε ποτά και στην παραδοσιακή ιατρική σαν υπογλυκαιμικό και προληπτικό των δευτερογενών συμπτωμάτων του διαβήτη. Παρόλα αυτά δεν υπήρχε καμία επιστημονική αναφορά σχετικά με αυτές τις αναφερόμενες δράσεις. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε λεπτομερής ανάλυση του φαινολικού περιεχομένου των καρπών, έλεγχος διαφόρων εκχυλισμάτων σχετικά με την αντιοξειδωτική ικανότητα (δοκιμή ρίζας DPPH· και χημειοφωταύγειας της λουμινόλης), καθώς και έλεγχος αναστολής του ενζύμου αναγωγάση της αλδόζης. Το τελευταίο αυτό είναι υπεύθυνο για την εκδήλωση των δευτερογενών επιπλοκών σε διαβητικούς, όπου συγχρόνως έχουμε και γένεση ελευθέρων ριζών (κυτταρικό οξειδωτικό στρες). Για όλα τα παραπάνω ελέγχθηκαν πέντε διαφορετικοί τύποι καρπών για συγκριτικούς λόγους: (Α) Άγουροι καρποί, (Β) Καρποί που ωρίμασαν καλά πάνω στο δέντρο, (C) Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και αφέθηκαν να ωριμάσουν για μία εβδομάδα σε θερμοκρασία δωματίου, (D) Καρποί που συλλέχθηκαν άγουροι και αφέθηκαν να ωριμάσουν καλά για τρεις εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου & (E) Πολτός αώρων καρπών συσκευασμένος εν κενώ. Σαν παραδοσιακό φάρμακο χρησιμοποιούνται μόνο οι δύο τελευταίες κατηγορίες καρπών και γι’ αυτό είχε αξία ο συγκριτικός έλεγχος των πέντε κατηγοριών. Η ποιοτική και ποσοτική φυτοχημική ανάλυση των αρχικών εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε σε σύστημα LC-DAD-MS (ESI+), όπου η διευκρίνιση της δομής έγινε με τον μηχανισμό θραυσμάτωσης. Παράλληλα απομονώθηκαν ενώσεις για τις οποίες δεν ήταν δυνατή η ταυτοποίηση με το παραπάνω σύστημα και διευκρινίστηκε η δομή τους και με τη βοήθεια διαφόρων τεχνικών Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (φάσματα NMR) και HR-MS/MS. Η απομόνωση των ενώσεων πραγματοποιήθηκε με παρασκευαστικές τεχνικές όπως υγρή χρωματογραφία στήλης (CC), υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC), χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Από την φυτοχημκή ανάλυση διευκρινίσθηκαν ογδόντα ενώσεις που ανήκουν στις κατηγορίες των υδροξυβενζοϊκών οξέων, υδροξυφαινυλοπροπανοϊκών οξέων και παραγώγων, φλαβονοειδών και διφαινυλίων. Από τις ενώσεις που διευκρινίστηκαν, είκοσι ήταν νέες δομές: έξι διμερή της κερκετίνης, δύο διμερή της καιμφερόλης, δύο νέοι γλυκοζίτες της κερκετίνης, ένας σόρβυλο-εξοζίτης της κερκετίνης, ένας εξοζυλιωμένος 3-Ο- εστέρας της κερκετίνης, ένας 7-Ο-φερουλικός εστέρας της ακακετίνης, μία 7-Ο- εξοζυλιωμένη 3’,6’,5,7-τετραϋδρόξυ φλαβανόλη, ένα τριμερές παράγωγο του βανιλλικού οξέος, ένας ανυδρίτης του πρωτοκατεχικού οξέος, ένα πολύπλοκο πολυφαινολικό φαινυλοπροπανοειδές, δύο διφαινύλια και ένα παράγωγο οκταϋδροανθρακενίου. Επίσης απομονώθηκε ένα ακόρεστο τριγλυκερίδιο, του οποίου η δομή επιβεβαιώθηκε μερικώς μόνο με φάσματα NMR. Όλες οι κατηγορίες καρπών περιείχαν υψηλά ποσοστά εστέρων φαινυλοπροπανοϊκών οξέων με κινικό οξύ. Οι άγουρες κατηγορίες Α και C και ο πολτός των καρπών Ε περιείχαν υψηλά ποσοστά φλαβονοειδών και χαμηλά ποσοστά υδροξυβενζοϊκών οξέων. Το αντίστροφο διαπιστώθηκε για τις ώριμες κατηγορίες Β και D, όπου σύμφωνα με τον ποσοτικό προσδιορισμό κυριαρχούσαν τα υδροξυβενζοϊκά οξέα. Τα διφαινύλια απομονώθηκαν από την κατηγορία των καρπών που ωρίμασαν πάνω στο δέντρο και, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, αυτού του χημικού τύπου ενώσεις λειτουργούν στο φυτό ως φυτοαλεξίνες σε περιπτώσεις μυκησιακών προσβολών. Από τον αντιοξειδωτικό έλεγχο των διαφόρων εκχυλισμάτων με τις δύο τεχνικές αξιολόγησης φάνηκε ότι καλύτερη δράση εμφάνισαν οι καρποί των κατηγοριών A και C (άγουροι) καθώς και ο πολτός Ε, ενώ οι ώριμες κατηγορίες Β και D είχαν συγκριτικά μικρότερη δράση. Τα αποτελέσματα αυτά σχετίζονται με το φαινολικό περιεχόμενο των καρπών, αφού τα φλαβονοειδή είναι ισχυρότερα αντιοξειδωτικά από τα φαινολικά οξέα. Στην περίπτωση ελέγχου της αναστολής του ενζύμου αναγωγάση της αλδόζης, όλες οι κατηγορίες καρπών εμφάνισαν παραπλήσια δράση. Τα εκχυλίσματα του αιθέρα και οξικού αιθυλεστέρα όλων των καρπών είχαν πολύ καλή ικανότητα αναστολής του ενζύμου. Από τα βιβλιογραφικά δεδομένα προκύπτει ότι φλαβονοειδή και φαινυλοπροπανοειδείς εστέρες του κινικού οξέος έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν το ένζυμο αναγωγάση της αλδόζης in vitro. H δράση αυτή λοιπόν φαίνεται να σχετίζεται άμεσα με τις ενώσεις που απαντούν στα εκχυλίσματα με εξαίρεση τα διφαινύλια, τα οποία ελέγχθηκαν μετά την απομόνωσή τους και δεν εμφάνισαν αξιόλογη δράση. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη φυτοχημική μελέτη του φαινολικού περιεχομένου των καρπών του Sorbus domestica, καθώς και η πρώτη απόδειξη ότι οι καρποί θα μπορούσαν να δράσουν ταυτόχρονα σαν αντιοξειδωτικά και σαν αναστολείς των μακροχρόνιων δευτερογενών επιπλοκών του διαβήτη