The role and the prognostic significance of type I tyrosine kinase receptors in non - small cell lung carcinomas (NSCLC)

Lung cancer, and in particular non-small-cell lung cancer (NSCLC), remains the leading cause of cancer death throughout the world. The overall five-year survival is less than 15%. Lung cancer mortality is higher than the sum of mortality of breast, prostate and colon cancer together. Despite the diagnostic improvements and the new therapeutic agents, in the last decades, the percentage of the five-year survival has not been improved. Smoking cessation remains the best method for prevention and reduction of disease incidence. Patients are usually symptomatic (94%) by the time of diagnosis. The most common presenting symptoms are coughing, weight loss, dyspnea, thoracic pain, and hemoptysis. Squamous cell carcinoma and adenocarcinoma comprise the major histological subtypes. The TNM staging system is currently in use for the disease staging. There are three therapeutic approaches in use: surgery, radiotherapy and combination chemotherapy. Third line chemotherapy with EGFR (epidermal growth factor receptor) inhibitors is currently recommended in the advanced disease or when patients do not respond to the second line chemotherapy. However, in the future, novel targeted therapies could offer a wider range of therapeutic options for lung cancer patients. Recently, the progress on biology and genetics has contributed to a better understanding of lung cancer pathogenesis, implicating that lung cancer is the result of several genetic and epigenetic alterations. The latter are due to chronic exposure to a variety of carcinogens that result in the progressive transformation of a normal cell to neoplastic. The multicellular organisms’ homeostasis substantially depends on the proper presentation of a plethora of signals that cells are exposed to, during their lifetime. Various soluble agents regulate the activation status of the cellular receptors, connected via a complex signal transduction network, which generates further signals regulating a certain biological response. These cellular receptors include also the family of epidermal growth factor tyrosine kinase receptors. The epidermal growth factor receptor tyrosine kinase family consists of four members: the EGFR/c-erbB-1, the HER2/c-erbB-2/c-neu, the HER3/cerbB-3 and the HER4/c-erbB-4. All members of the EGFR family are characterized by an articulate structure, which consists of an extracellular component, where the ligand binds, a hydrophobic transmembrane component and an intracellular component with tyrosine kinase activity. A family of ligands, the EGF-related peptide growth factors, binds to the extracellular domain of ErbB receptors leading to the formation of both homo and heterodimers. Subsequently dimerization triggers the intrinsic tyrosine kinase activity of the receptors and autophosphorylation of specific tyrosine residues within the cytoplasmic domain. These phosphorylated residues serve as docking sites for a variety of signal transducers (mediators), which regulate the membrane to nucleus complex network of signal transmission, leading to the modification of a biological response according to a certain signal. The deregulation of this strictly controlled system due to protein overexpression, or mutations of important components of this pathway, and/or the autocrine stimulation through ectopic loops of growth factors, has been correlated with the development of cancer. There are extensive studies on the role of the EGFR family receptors in the pathogenesis of NSCLC. The most studied receptors are the c-erbB-1 (EGFR) and the c-erbB-2 (HER-2 or c-neu). It has been supported that these receptors are involved in lung cancer pathogenesis, development of metastasis, resistance to treatment, and overall prognosis. However contradictory results have also been reported. At present, targeted therapies are clinically implemented against these receptors. Nevertheless, it remains unknown who are the patients particularly prone to benefit from such a treatment. Based on the current literature, we embarked on an investigation of the immunohistochemical expression of all four EGFR family members (EGFR, c138 erbB-2, c-erbB-3 and c-erbB-4) in paraffin blocks from 209 patients with NSCLC. We also studied their co-expression, the expression of the potential receptors pairs and we correlated our findings with patients’ demographic parameters, tumor histological types, degree of differentiation, disease stage, disease-free interval, and patients’ overall survival. Additionally, we investigated whether the expression or the co-expression of the above receptors represent an independent prognostic factor in NSCLC patients. The study material consisted of 209 lung cancer tissue specimens, 129 of which were obtained by open surgery. Five serial sections, 4-μm thick, were cut from each, paraffin-embedded, lung tissue block. Four of the serial sections of each patient were used for the immunohistochemical study. A standardized quantification method was employed for the evaluation of the results of immunostaining, for each one of the c-erbB receptors. Briefly, when more than 10% of the cancer cells presented mild to moderate complete membrane staining, the section was graded as weakly positive (2+), while when more than 10% of the cancer cells presented intense complete membrane staining, it was graded as strongly positive (3+). All the other patterns of staining were considered negative (0 or 1+). We detected overexpression of the receptors c-erbB-1, c-erbB-2, c-erbB-3 and c-erbB-4 in 47.7%, 23.7%, 6.5% and 25.2% of NSCLC patients, respectively. Twenty-nine percent of all the samples studied were negative for all the receptors of the c-erbB family, while only one of the receptors was overexpressed in 43.7% of cases. The co-expression of two and three receptors was 22.6% and 4%, respectively, while only one sample (0.5%) expressed all four receptors. The c-erbB-1 receptor was overexpressed in older patients, in squamous cell carcinomas and in tumors with poor differentiation. The c-erbB-2 receptor was overexpressed in adenocarcinomas and in poorly differentiated tumors. The c-erbB-3 receptor was overexpressed mainly in poorly differentiated tumors. The c-erbB-4 receptor was overexpressed in females and in patients with advanced disease. Considering the heterodimeric properties of c-erbB receptors and the fact that different heterodimeric patterns may promote different biological activities (activation of different biological pathways), we studied the protein expression levels of the six potential receptor pairs. The c-erbB-1 and c-erbB-2 receptor pair was co-overexpressed in elderly patients. The c-erbB-1 and cerbB-4 receptor pair was co-overexpressed in the female patients. For the cerbB-1/c-erbB-3, c-erbB-2/c-erbB-3, c-erbB-2/c-erbB-4 and c-erbB-3/ c-erbB-4 receptor pairs no statistically significant correlations were found in regards to age, sex, histological tumor type, differentiation or disease stage. The overexpression of the c-erbB-1 receptor and the c-erbB-1/c-erbB-2 and c-erbB-3/c-erbB-4 receptors pairs showed a statistically significant correlation with the disease control rate. The overexpression of c-erbB-3 receptor and the co-overexpression of c-erbB-1 and c-erbB-4 receptors showed a statistically significant correlation with low median overall survival. The multivariate analysis failed to reveal any independent statistically significant correlation between the protein overexpression or co-overexpression of the c-erbB receptors and overall survival. The above findings suggest that the overexpression of a single receptor or the co-overexpression of the receptors pairs correlate with certain demographic parameters, disease control rate and disease outcome. Our results also support the concept of developing and using small molecules to inhibit the c-erbB receptors in carefully selected patients. The simultaneous inhibition of more than one receptors may enhance the anti-neoplastic activity of these agents. Further studies on the expression of the c-erbB family heterodimers are needed in order to develop predictive markers for the response to targeted molecular therapies.Το καρκίνωμα του πνεύμονα αποτελεί την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνωμα σε όλες τις ανεπτυγμένες χώρες. Η συνολική 5-ετής επιβίωση των ασθενών είναι μικρότερη του 15%. Η θνητότητα από καρκίνωμα του πνεύμονα είναι μεγαλύτερη από το σύνολο της θνητότητας τουκαρκινώματος του μαστού, του προστάτη και του παχέος εντέρου. Το ποσοστό της πενταετούς επιβίωσης δεν έχει ουσιαστικά μεταβληθεί στις τελευταίες δεκαετίες, παρά την βελτίωση των διαγνωστικών μέσων και την εφαρμογή νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Η εξάλειψη της καπνιστικής συνήθειας με την επιβολή κατάλληλων μέτρων αποτελεί την καλύτερη μέθοδοπρόληψης και μείωσης της επίπτωσης της νόσου. Το 94% των ασθενών είναι συμπτωματικοί κατά τη στιγμή της διάγνωσης και τα συνηθέστερα συμπτώματα είναι ο βήχας, η απώλεια βάρους, η δύσπνοια, ο θωρακικός πόνος και η αιμόπτυση. Κυρίως λόγω της διαφορετικής θεραπευτικής αντιμετώπισης, τα καρκινώματα του πνεύμονα διακρίνονται σε μικροκυτταρικά και μη-μικροκυτταρικά (ΜΜΚΠ). Οι συχνότερα απαντώμενοι ιστολογικοί τύποι των τελευταίων είναι το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα και το αδενοκαρκίνωμα. Για την σταδιοποίηση ακολουθείται το σύστημα TNM και για τη θεραπεία τρεις μέθοδοι: η χειρουργική, η ακτινοθεραπεία και η συνδυασμένη χημειοθεραπεία. Στο προχωρημένο στάδιο της νόσου και εφόσον οι ασθενείςδεν ανταποκριθούν στη χημειοθεραπεία της δεύτερης γραμμής, τότε προτείνεται η τρίτης γραμμής θεραπεία με αναστολείς του υποδοχέα του επιδερμιδικού αυξητικού παράγοντα (EGFR). Πιστεύεται ότι μέσα στα επόμενα χρόνια περισσότερες στοχευμένες θεραπείες θα γίνουν αποδεκτές διευρύνοντας έτσι τις επιλογές για τη θεραπεία του καρκινώματος του πνεύμονα. Η σημαντική πρόοδος των τελευταίων ετών στους τομείς της βιολογίας και της γενετικής έχει συμβάλει ώστε να είναι γενικά παραδεκτή η άποψη ότι το καρκίνωμα του πνεύμονα αποτελεί την τελική έκφραση μιας πολυσταδιακής εξελικτικής διαδικασίας, η οποία οφείλεται σε γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις που προκαλούνται από την χρόνια έκθεση στα διάφορα καρκινογόνα, με συνέπεια την προοδευτική μετάπτωση (εξαλλαγή) του φυσιολογικού κυττάρου σε νεοπλασματικό. Η ομοιοστασία των πολυκύτταρων οργανισμών εξαρτάται σημαντικά από τη σωστή παρουσίαση πληθώρας σημάτων, στα οποία τα κύτταρα εκτίθενται κατά τη διάρκεια της ζωής. Ποικίλοι διαλυτοί παράγοντες, οι οποίοι είναι συζευγμένοι με ένα σύνθετο δίκτυο μετάδοσης του σήματος, ρυθμίζουν το επίπεδο ενεργοποίησης των κυτταρικών υποδοχέων. Το δίκτυο αυτό τελικά, δημιουργεί σήματα που καθορίζουν την κατάλληλη βιολογική απάντηση. Σε αυτούς τους κυτταρικούς υποδοχείς ανήκουν και οι υποδοχείς τυροσινικής κινάσης, μία από τις οικογένειες των οποίων είναι η οικογένεια των υποδοχέων τυροσινικής κινάσης του επιδερμιδικού αυξητικού παράγοντα. Η οικογένεια των υποδοχέων τυροσινικής κινάσης του επιδερμιδικού αυξητικού παράγοντα αποτελείται από τέσσερα μέλη: τον EGFR/c-erbB-1, τον HER2/c-erbB-2/c-neu, τον HER3/c-erbB-3 και τον HER4/c-erbB-4. Όλα τα μέλη της οικογένειας του επιδερμιδικού αυξητικού παράγοντα χαρακτηρίζονται από αρθρωτή δομή, η οποία αποτελείται από ένα εξωκυττάριο τμήμα στο οποίο συνδέεται ο προσδέτης (ligand-binding domain), ένα υδρόφοβο διαμεμβρανικό και ένα ενδοκυττάριο τμήμα με δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης. Η σύνδεση του προσδέτη προάγει την δημιουργία ομο- ή ετεροδιμερών, τα οποία με τη σειρά τους πυροδοτούν την αυτοφωσφορυλίωση κυτταροπλασματικών περιοχών με ενεργότητα κινάσης της τυροσίνης. Τα φωσφορυλιωμένα αυτά αμινοξέα παριστούν θέσεις πρόσδεσης για ποικιλία μεταβιβαστών σήματος και ρυθμίζουν τα εγγύς της μεμβράνης βήματα ενός σύνθετου δικτύου σηματοδότησης με τελικό αποτέλεσμα την κατάλληλη κυτταρική απάντηση σε ένα δεδομένο σήμα. Η απορρύθμιση αυτού του αυστηρά ελεγχόμενου συστήματος μεταγωγής του σήματος από πρωτεϊνική υπερέκφραση ή γονιδιακή επέκταση (ενίσχυση, amplification) του υποδοχέα ή μεταλλάξεις σε ζωτικής σημασίας στοιχεία της οδού και/ή αυτοκρινής διέγερση μέσω έκτοπων αγκυλών αυξητικών παραγόντων είναι συχνά συνδεδεμένη με την ανάπτυξη Καρκινωμάτων. Εκτεταμένες είναι οι μελέτες σε σχέση με τον ρόλο των υποδοχέων της οικογένειας του EGFR στο ΜΜΚΠ. Οι περισσότερο μελετημένοι υποδοχείς είναι οι c-erbB-1 (EGFR) και c-erbB-2 (HER-2 ή c-neu). Έχει υποστηριχθεί ότι οι υποδοχείς αυτοί εμπλέκονται στην ανάπτυξη, τη μετάσταση, την αντίσταση στη θεραπεία και την πρόγνωση του καρκινώματος του πνεύμονα, ενώ σε άλλες μελέτες δεν βρέθηκαν τέτοιες συσχετίσεις. Σήμερα αποτελούν γεγονός οι στοχευμένες θεραπείες έναντι των υποδοχέων αυτών, χωρίς όμως να είναι γνωστή πλήρως η ομάδα των ασθενών η οποία θα μπορούσε να ωφεληθεί από μια τέτοια θεραπεία. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τα ανωτέρω αποφασίσαμε να διεξαγάγουμε την παρούσα μελέτη, η οποία έχει ως στόχο τον καθορισμό, με τη βοήθεια της ανοσοϊστοχημείας, του επιπέδου έκφρασης όλων των μελών της οικογένειας των υποδοχέων του επιδερμιδικού αυξητικού παράγοντα (EGF-R, c-erbB-2, cerbB-3 και c-erbB-4) σε 209 μη μικροκυτταρικά καρκινώματα του πνεύμονα (ΜΜΚΠ). Ζητούμενο επίσης της μελέτης αποτελεί ο προσδιορισμός της τυχόν συνέκφρασης των ανωτέρω υποδοχέων, η ενδεχόμενη συνέκφραση ζευγών υποδοχέων, καθώς επίσης και ο συσχετισμός των ευρημάτων με τα δημογραφικά δεδομένα των ασθενών, τον ιστολογικό τύπο του καρκινώματος, τον βαθμό διαφοροποίησης, το στάδιο της νόσου, το ελεύθερο νόσου διάστημα και την επιβίωση των ασθενών. Τέλος, ένα ακόμη στόχο αυτής της μελέτης αποτελεί η απάντηση στο ερώτημα αν η έκφραση ή η συνέκφραση των ανωτέρω υποδοχέων αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για την κλινική έκβαση των ασθενών. Το υλικό αποτέλεσαν 209 παρασκευάσματα μη-μικροκυτταρικού καρκινώματος πνεύμονα, 129 από τα οποία ήταν χειρουργικά. Με την βοήθεια μικροτόμου κόπηκαν, από τους επιλεγμένους κύβους παραφίνης, 5 διαδοχικές τομές πάχους 4-μm, οι τέσσερις από τις οποίες χρησιμοποιήθηκαν για την εφαρμογή ανοσοϊστοχημικής τεχνικής. Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της ανοσοϊστοχημικής χρώσης, για όλα τα μέλη της οικογένειας του c-erbB, η ανοσοαντίδραση θεωρήθηκε ως ασθενώς θετική (2+) όταν περισσότερα από το 10% των καρκινικών κυττάρων έδειξαν ασθενή έως μέτρια, πλήρη μεμβρανική χρώση και ως έντονα θετική (3+) όταν παρατηρήθηκε έντονη, πλήρης μεμβρανική χρώση σε περισσότερα από το 10% των κυττάρων του καρκινώματος. Όλα τα άλλα πρότυπα χρώσης θεωρήθηκαν αρνητικά (0 ή 1+). Παρατηρήθηκε υπερέκφραση των υποδοχέων c-erbB-1, c-erbB-2, c-erbB-3 και c-erbB-4 στο 47,7%, 23,7%, 6,5% και 25,2% των περιπτώσεων, αντίστοιχα. Όσον αφορά τον αριθμό των θετικών υποδοχέων στα περιστατικά που μελετήθηκαν, περίπου το 29% των περιπτώσεων ήταν αρνητικό και για τους τέσσερις c-erbB υποδοχείς, υπερέκφραση ενός μόνον υποδοχέα βρέθηκε στο 43,7% των περιπτώσεων, ενώ η συνέκφραση δύο και τριών υποδοχέων ήταν 22,6 και 4%, αντίστοιχα. Σε μία περίπτωση (0,5%) βρέθηκε να υπερεκφράζονται και οι τέσσερις υποδοχείς. Ο υποδοχέας c-erbB-1 βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε ασθενείς μεγαλύτερης ηλικίας, στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα και σε όγκους με χαμηλή διαφοροποίηση. Ο υποδοχέας c-erbB-2 βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε αδενοκαρκινώματα και όγκους με χαμηλή διαφοροποίηση. Ο υποδοχέας c-erbB-3 βρέθηκε να υπερεκφράζεται περισσότερο σε χαμηλής διαφοροποίησης καρκινώματα του πνεύμονα. Τέλος, ο υποδοχέας c-erbB-4 βρέθηκε να υπερεκφράζεται στο γυναικείο φύλο και σε προχωρημένα στάδια της νόσου. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τον ετεροδιμερισμό των c-erbB υποδοχέων, καθώς και το ότι διαφορετικά πρότυπα ετεροδιμερισμού μπορεί να προάγουν διαφορετικές βιολογικές ενέργειες (υπό την έννοια της ενεργοποίησης διαφορετικών βιολογικών μονοπατιών), εξετάστηκαν τα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης των έξι πιθανών ζευγών υποδοχέων. Το ζεύγος των υποδοχέων c-erbB-1 και c-erbB-2 βρέθηκε να συν-υπερεκφράζεται σε ηλικιωμένα άτομα. Το ζεύγος των υποδοχέων c-erbB-1 και c-erbB-4 βρέθηκε να συν-υπερεκφράζεται στο γυναικείο φύλο. Για τα ζεύγη c-erbB-1/c-erbB-3, c-erbB-2/c-erbB-3, c-erbB-2/c-erbB-4 και c-erbB-3/c-erbB-4 δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με την ηλικία, το φύλο, τον τύπο του καρκινώματος, την διαφοροποίηση και το στάδιο της νόσου. Η έντονη υπερέκφραση του υποδοχέα c-erbB-1 και των ζευγών υποδοχέων c-erbB-1/cerbB-2 και c-erbB-3/c-erbB-4 βρέθηκε να παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με μικρότερη ανταπόκριση της νόσου στην χημειοθεραπεία. Η υπερέκφραση του c-erbB-3 υποδοχέα και η συν-υπερέκφραση των υποδοχέων c-erbB-1 και c-erbB-4 παρουσίαζε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με μειωμένη μέση συνολική επιβίωση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση απέτυχε να αναδείξει στατιστικά σημαντική συσχέτιση της πρωτεϊνικής υπερέκφρασης ή της συν-υπερέκφρασης των cerbB υποδοχέων με τη συνολική επιβίωση. Τα ανωτέρω ευρήματα υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση μεμονωμένων ή η συν-υπερέκφραση ορισμένων υποδοχέων c-erbB συσχετίζεται με κάποιους από τους δημογραφικούς παράγοντες, το ποσοστό ελέγχου της νόσου και την έκβαση της νόσου των ασθενών. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν επίσης τη σκοπιμότητα της ανάπτυξης και χρήσης μικρών μορίων τα οποία αναστέλλουν τους υποδοχείς αυτούς, ιδιαίτερα σε μια ομάδα επιλεγμένων ασθενών. Η ταυτόχρονη αναστολή περισσότερων του ενός υποδοχέων πιθανά να ενισχύσει την αντι-νεοπλασματική δράση αυτών των φαρμάκων. Η περαιτέρω κατανόηση της υπερέκφρασης των ετεροδιμερισμένων ζευγών της οικογένειας των υποδοχέων του c-erbB μπορεί να αποτελέσει χρήσιμο προβλεπτικό δείκτη της ανταπόκρισης σε στοχευμένες μοριακές θεραπείες με αναστολείς των μορίων αυτής της οικογένειας υποδοχέων