The genotype of the prion protein of Cyprus sheep and its association with scrapie

Scrapie which is known in Europe for the past 270 years was first diagnosed in Cyprus sheep in 1985. In spite of the intensive measures taken by the Veterinary Services of Cyprus to control the disease since 1987, the number of the scrapie-affected flocks increases every year causing some concern. Results of research abroad have shown that polymorphisms within the PrP gene, mainly located at codons 136, 154 and 171 are closely associated with scrapie susceptibility or resistance. The purpose of this study was to contribute to the reduction of the incidence of scrapie in Cyprus with the application of a selective breeding programme, which should be based on the determination of the PrP genotype of the Cyprus sheep. This study is divided into three parts. In the first part the literature on scrapie and the appearance of scrapie in Cyprus is reviewed. In the second part our experimental work which refers to: (a) the investigation of the PrP gene of the sheep of the breeds Chios and Local (breed survey) and (b) the comparison of the PrP genotype of clinical suspect and histopathologically positive cases with those of “healthy” control-sheep (case-control study) is presented. During our study in order to determine the PrP genotypes polymerase chain reaction (PCR), restriction enzyme analysis, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and DNA sequencing, were performed. In particular during the breed survey study we investigated the PrP gene of 145 sheep of the Chios breed and 171 of the Local breed. In total twelve different PrP genotypes were revealed, nine in each breed. The results of the above study show that the predominant genotype in the sheep of both breeds is AA136RR154QQ171. This genotype is regarded very sensitive. The allele K171 was fairly common in the sheep of Chios breed and the allele H171 was found only in the sheep of Local breed. In the case-control study the PrP genotype of 106 clinical suspect and histopathologicaly positive (scrapie group) sheep and 358 healthy control sheep (control group) was investigated. In total 14 different PrP genotypes were determined during this study. In the scrapie group only three PrP genotypes were identified and in the control group 14 genotypes. The genotypes at codons 136 and 154 did not vary in the scrapie group. This result indicates that in Cyprus sheep there is strongly association between codon 171 and scrapie susceptibility. In the third part of this study there is a description how the nuclear flock with sheep with resistant genotypes was created. Overall, the data obtained from our studies suggest that the most susceptible genotype in the sheep population of Cyprus is the AA136RR154QQ171. The decision of Veterinary Services to adopt a selective breeding programme seems to be the most appropriate choice. However, we do not know whether sheep with the resistant genotype (RR171) can be carriers of the infectious protein PrPSc, without showing clinical signs of the disease and therefore can serve as a reservoir for infectious agent. To have the answer to the above question a further research is needed.Η τρομώδης νόσος, η οποία είναι γνωστή στην Ευρώπη εδώ και περίπου 270 χρόνια, διαγνώστηκε για πρώτη φορά στα πρόβατα της Κύπρου το 1985. Παρά τα έντονα μέτρα τα οποία εφαρμόζουν οι Κτηνιατρικές Υπηρεσίες για έλεγχο της νόσου από το 1987, ο αριθμός των μολυσμένων ποιμνίων κάθε χρόνο αυξάνεται ανησυχητικά. Έρευνες στο εξωτερικό, έχουν δείξει ότι πολυμορφισμοί στο γονίδιο PrP, οι οποίοι βρίσκονται κυρίως στα κωδικόνια 136, 154 και 171 είναι στενά συνδεδεμένοι με την ευαισθησία ή την ανθεκτικότητα στην τρομώδη νόσο. Σκοπός της έρευνάς μας ήταν η συμβολή στη μείωση της συχνότητας εμφάνισης της τρομώδους νόσου στην Κύπρο με την εφαρμογή προγράμματος επιλεκτικής εκτροφής, το οποίο να βασίζεται στον καθορισμό του γονότυπου PrP των κυπριακών προβάτων. Η εργασία αυτή διαιρείται σε τρεις ενότητες. Στην πρώτη παρουσιάζονται τα μέχρι σήμερα διεθνή βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με την τρομώδη νόσο, καθώς και την εμφάνιση της νόσου στην Κύπρο. Στη δεύτερη ενότητα, παρουσιάζεται η δική μας έρευνα η οποία αφορά: (α) τη μελέτη του γονιδίου PrP των προβάτων των φυλών Χίου και Ντόπιας (breed survey) και (β) τη συγκριτική μελέτη του γονότυπου PrP των κλινικώς υπόπτων και ιστοπαθολογικά θετικών προβάτων και «υγιών» προβάτων-μαρτύρων (case-control study). Για την πραγματοποίηση της έρευνάς μας χρησιμοποιήθηκαν οι μοριακές μέθοδοι της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), της ανάλυσης με ενδονουκλεάση περιορισμού (restriction enzyme analysis), της μετουσιωτικής διαβαθμισμένης ηλεκτροφορητικής ανάλυσης (DGGE) και της εξακρίβωσης αλληλουχίας των βάσεων (DNA sequencing). Συγκεκριμένα, για την πραγματοποίηση της πρώτης ερευνητικής εργασίας διερευνήθηκε ο γονότυπος της PrP 145 προβάτων της φυλής Χίου και 171 προβάτων της Ντόπιας φυλής. Κατά την εργασία αυτή καθορίστηκαν συνολικά 12 διαφορετικοί γονότυποι, 9 σε κάθε φυλή. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο γονότυπος με τη μεγαλύτερη συχνότητα στα ζώα και των δύο φυλών είναι ο AA136RR154QQ171, ο οποίος θεωρείται πολύ ευαίσθητος έναντι της τρομώδους νόσου. Στα ζώα της φυλής Χίου εμφανίζεται σε αρκετά μεγάλη συχνότητα το αλληλόμορφο Κ171, ενώ στη Ντόπια φυλή το αλληλόμορφο H171. Στη Ντόπια φυλή το αλληλόμορφο R171 εμφανίζεται συχνότερα από ότι στη φυλή Χίου. Για την πραγματοποίηση της δεύτερης ερευνητικής εργασίας διερευνήθηκε ο γονότυπος 106 κλινικώς υπόπτων και ιστοπαθολογικά θετικών προβάτων και 358 «υγιών» προβάτων-μαρτύρων. Κατά την εργασία αυτή καθορίστηκαν 14 συνολικά διαφορετικοί γονότυποι από τους οποίους μόνο τρεις βρέθηκαν στην ομάδα των θετικών ζώων. Όπως και στην προηγούμενη εργασία ο γονότυπος που επικρατεί είναι ο AA136RR154QQ171. Κανένας πολυμορφισμός δεν βρέθηκε στα κωδικόνια 136 και 154 του γονιδίου PrP των θετικών ζώων. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι στα πρόβατα της Κύπρου, μεγάλη σχέση με την τρομώδη νόσο έχει το κωδικόνιο 171. Τέλος στη τρίτη ενότητα περιγράφεται η δημιουργία μονάδας-πυρήνα με ζώα με ανθεκτικό γονότυπο PrP, η οποία αποτελεί βασικά αξιοποιήση των δεδομένων/ αποτελεσμάτων της έρευνάς μας. Συμπεραίνεται λοιπόν ότι τα πρόβατα της Κύπρου έχουν ευαίσθητο ως προς την τρομώδη νόσο γονότυπο και ότι η απόφασή μας να δημιουργήσουμε την μονάδα-πυρήνα με ζώα με ανθεκτικό γονότυπο ήταν η εκ των πραγμάτων ενδεδειγμένη επιλογή. Φυσικά ακόμη δεν γνωρίζουμε αν τα πρόβατα με τον ανθεκτικό γονότυπο (RR171) μπορούν να είναι φορείς της μολυσματικής πρωτεΐνης PrPSc χωρίς να παρουσιάζουν κλινικά συμπτώματα και κατά συνέπεια να λειτουργούν ως δεξαμενή του μολυσματικού παράγοντα. Αν και οι μέχρι σήμερα ενδείξεις είναι ικανοποιητικές, για να απαντηθεί το ερώτημα αυτό σίγουρα χρειάζονται επιπλέον έρευνες