ALLOSTERIC AND CATALYTIC MECHANISM OF GLYCOGEN PHOSPHORYLASE: KINETIC AND CRYSTALLOGRAPHIC STUDIES ON THE R STATE CONFORMATION OF THE ENZYME

ΣΤΗΝ ΔΙΑΤΡΙΒΗ, ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΕ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΘΕΙΙΚΟΥ ΑΜΜΩΝΙΟΥ ΣΤΙΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗΣ. Η ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΥΨΗΛΩΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΩΝ ΘΕΙΙΚΟΥ ΑΜΜΩΝΙΟΥ ΠΡΟΑΓΕΙ ΣΤΗΝ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗ B ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗΣ A. ΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΜΦΩΝΟΥΝ ΜΕ ΤΗΝ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΠΩΣ ΤΑ ΘΕΙΙΚΑ ΙΟΝΤΑ ΣΥΝΔΕΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΚΕΝΤΡΟ ΤΗΣ SER.14 ΚΑΙ ΟΤΙ ΟΙ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ ΘΕΙΙΚΩΝ ΙΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΣΤΟ ΚΕΝΤΡΟ ΑΥΤΟ ΕΙΝΑΙ ΥΠΕΥΘΥΝΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗΣ B ΑΠΟ ΤΟ ΘΕΙΙΚΟ ΑΜΜΩΝΙΟ ΟΙ ΜΟΝΟΚΛΙΝΕΙΣ ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΙ ΤΗΣ R ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗΣ ΤΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗΣ B ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΑΝ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΠΑΡΟΜΟΙΑ ΜΕ ΕΚΕΙΝΗΝ ΤΗΣ ΤΕΤΡΑΜΕΡΟΥΣ ΜΟΡΦΗΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΣΤΟ ΔΙΑΛΥΜΑ. ΩΣΤΟΣΟ ΒΡΕΘΗΚΑΝ ΜΕΓΑΛΕΣ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΗΣ ΔΙΜΕΡΟΥΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗΣ ΣΤΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΚΑΙ ΤΗΣ ΤΕΤΡΑΜΕΡΟΥΣ ΚΡΥΣΤΑΛΛΙΚΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗΣ. ΑΝΑΠΤΥΧΘΗΚΑΝ ΜΟΝΟΚΛΙΝΕΙΣ ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΙ ΤΗΣ PLPP-ΦΩΣΦΟΡΥΛΑΣΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΘΕΙΙΚΟΥ ΑΜΜΩΝΙΟΥ ΚΑΙ IMP ΚΑΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΘΗΚΕ Η ΤΡΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗ ΔΟΜΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΟΤΗΤΑ 2.8 Α ΜΕ ΠΕΡΙΘΛΑΣΗ ΑΚΤΙΝΩΝ Χ (ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ R=0.21). ΕΓΙΝΕ ΔΟΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΣΥΝΔΕΣΗΣ ΤΟΥ IMP ΣΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΚΑΘΩΣ ΕΠΙΣΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΣΥΝΕΝΖΥΜΟΥ (PLPP) ΣΤΗΝ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ.IN THIS WORK, THE EFFECT OF THE AMMONIUM SULPHATE ACTIVATION ON THE SOLUTION PROPERTIES OF PHOSPHORYLASE HAS BEEN STUDIED. AMMONIUM SULPHATE, WHEN PRESENT AT HIGH CONCENTRATIONS, INDUCE PROPERTIES OF PHOSPHORYLASE A IN PHOSPHORYLASE B.THE DATA ARE CONSISTENT WITH THE INTERPRETATION THAT SULPHATES BIND TO THE SER.14 SITE AND THE SULPHATE-PROTEIN INTERACTIONS AT THIS SITE ARE RESPONSIBLE FOR ACTIVATION OF PHOSPHORYLASE B. R-STATE MONOCLINIC CRYSTALS OF PHOSPHORYLASEWERE SHOWN TO BE CATALYTICALLY ACTIVE. THEIR ACTIVITY IS SIMILAR TO THAT DETERMINED IN SOLUTION FOR THE ENZYME TETRAMER. HOWEVER, LARGE DIFFERENCES WERE FOUND BETWEEN THE SOLUBLE DIMERIC AND CRYSTALLINE ENZYME. PLPP-PHOSPHORYLASE WAS CRYSTALLIZED IN THE PRESENCE OF IMP AND AMMONIUM SULPHATE IN THE MONOCLINICR STATE CRYSTAL FORM AND THE STRUCTURE REFINED FROM X-RAY DATA TO 2.8 A RESOLUTION TO A CRYSTALLOGRAPHIC R VALUE OF 0.21. A STRUCTURAL STUDY OF THE BINDING OF IMP TO THE ENZYME WAS PERFORMED. THE INFLUENCE OF THE COFACTOR (PLPP) ONTHE CONFORMATIONAL STATE OF THE PROTEIN WAS ALSO STUDIED