Enterovirus localization in the spleen : detection of multiple targets within a single tissue section

TIIVISTELMÄ Enteroviruksien sijainnit pernassa – Monien markkerien havaitseminen Tutkielman tausta ja tavoitteet: Immunofluoresenssivärjäyksessä käytetään fluoresoivia vasta-aineita antigeenien värjäämiseen. Fluoresoivat vasta-aineet voidaan pestä pois kudokselta eluutioliuoksilla kudoksen kuvantamisen jälkeen. Tämä mahdollistaa kudoksen peräkkäisen värjäämisen monien vasta-aineiden avulla. Kokonainen kudosleike voidaan kuvantaa modernilla virtuaalimikroskooppijärjestelmällä, ja peräjälkeen värjätyn kudosleikkeen kuvat voidaan yhdistää yhdeksi kuvaksi, joka ilmentää monia kudosmarkkereita. Yksi tämän tutkimuksen tavoitteista oli pystyttää eluutio- ja kuvantamisprotokolla, jonka avulla pystyttäisiin peräjälkeen värjäämään pernanäytteitä. Kun tämä protokolla oli pystytetty, pernanäytteitä tyypin 1 diabeetikoilta, tyypin 1 diabeteksen kaltaisilta autovasta-aine positiivisilta potilailta ja kontrolleilta pystyttiin värjäämään. Pernakudosta värjättiin enterovirusvasta-aineella ja pernan lymfosyyttivasta-aineilla ja näiden kolokalisaatiota tutkittiin. Materiaalit ja menetelmät: Eluutio- ja kuvantamisprotokolla pystytettiin käyttämällä elinluovuttajien pernanäytteitä. Kudosnäytteitä värjättiin enterovirusvasta-aineella ja monilla lymfosyyttivasta-aineilla. Vasta-aineiden värjäämistä testattiin sekä yksinkertaisilla että monivärjäysmenetelmillä. Monivärjäysmenetelmää testattiin vasta-aine-cocktail-protokollalla ja Fab-fragmentilla, joka estää vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen värjäysten välissä. Vasta-aineiden eluutiota testattiin SDS pH2 liuoksella ja 2-ME/SDS liuoksella. Leikkeiden kuvantaminen tehtiin Slidestrider -virtuaalimikroskopiajärjestelmällä. Kun eluutio- ja kuvantamisprotokolla oli pystytetty, optimoiduilla vasta-aineilla värjättiin pernanäytteitä tyypin 1 diabeetikoilta, tyypin 1 diabetekseen liittyviltä autovasta-aine positiivisilta henkilöiltä ja kontrolleilta. Tulokset: Vasta-aine -cocktail-protokolla ja Fab-fragmentilla blokkaaminen osoittautuivat toimimattomiksi värjäysmenetelmiksi tätä työtä varten, ja värjäykset päädyttiin tekemään yksinkertaisella menetelmällä. 2-ME/SDS osoittautui toimivaksi eluutioliuokseksi kaikille testatuille vasta-aineille, ja sitä käytettiin lopullisessa värjäysprotokollassa pernanäyteille. Slidestrider -virtuaalimikroskopiajärjestelmä osoittautui haasteelliseksi, ja sen takia ainoastaan enteroviruspositiiviset kohdat kudoksilta kuvannettiin. Eri markkereilla otetut kuvat yhdistettiin yhdeksi kuvaksi ja huomattiin enteroviruksen kolokalisoituvan eniten CD3 (T-solu) ja CD68 (makrofagi) markkerien kanssa. Johtopäätökset: Toimiva eluutio- ja kuvantamisprotokolla saatiin pystytettyä, mikä säästää arvokasta kudosmateriaalia mahdollistaen useamman markkerin analysoinnin yhdestä ja samasta kudosleikkeestä. Pernanäytteiltä löytyi enteroviruspositiivisia soluja ja kolokalisaatiota useamman testatun markkerin kanssa. Pystytettyä eluutioprotokollaa voidaan käyttää myös muiden kudosten värjäämisessä. Kuvantamismenetelmä osoittautui käytetyllä laitteistolla haasteelliseksi, minkä vuoksi jatkossa muita olemassa olevia laitteistoja on syytä harkita. ABSTRACT Enterovirus localization in the spleen – Detection of multiple targets Background and aims: In immunofluorescence staining, fluorescently tagged antibodies are used to target antigens. Antibodies stained using immunofluorescence can be washed off the tissue using elution buffers after imaging the sample. This makes possible the consecutive staining of a sample with multiple markers. The whole slide imaging of a tissue sample is possible with a modern virtual microscopy system. Consecutively stained tissue samples can be imaged using a virtual microscope tissue scanner and the images taken can be combined into one image displaying multiple markers. One of the aims of this study was to set up an elution and imaging workflow for the consecutive staining of spleen tissue samples. With this workflow in place, spleen tissue samples from type 1 diabetics, type 1 diabetes -related autoantibody-positive patients and control donors were analyzed for enterovirus positivity and enterovirus colocalization with splenic lymphocyte markers. Materials and methods: The elution and imaging workflow was set up using spleen samples from organ donors. The samples were stained with an anti-enterovirus marker and several lymphocyte markers. Antibodies were tested with both a single staining and multiple staining protocols. The multiple staining of antibodies was tested with an antibody cocktail and using a Fab-fragment as a blocking step in between stains. The elution of antibodies was tested with an SDS pH2 solution and a 2-ME/SDS solution. The imaging of samples was done with the Slidestrider virtual microscopy system. With the ready elution and imaging workflow, spleen samples from type 1 diabetics, type 1 diabetes -related autoantibody-positive patients and control donors samples were stained with optimal antibody concentrations and imaged. Results: The cocktail and Fab fragment double staining methods did not prove effective for this study, and stainings were done with one antibody at a time. 2-ME/SDS was an effective elution solution for all tested antibodies, and it was used as the elution solution in the final staining of spleen samples. Due to difficulties with the Slidestrider virtual microscopy system, only the enterovirus-positive sites on the samples were imaged. The images for the different markers were then combined, and the enterovirus-positive sites were observed to colocalize most with the CD3 (T cell) and the CD68 (macrophage) markers. Conclusions: The elution and imaging workflow was successfully set up, saving precious sample material and facilitating the staining of multiple markers on the same tissue sample. The spleen samples were enterovirus positive and the positivity colocalized with multiple markers. The protocol set up in this study can be used for staining other tissue samples. The imaging system proved challenging for executing the imaging workflow, and other imaging systems should be considered for future stainings