Ikääntymisen yhteydessä tapahtuvat muutokset DNA:n metylaatiossa ja epigeneettisen kellon ominaisuudet

Tausta: Ikääntyminen on jatkuva prosessi, jonka aikana organismin fysiologinen eheys heikkenee. Tämän seurauksena yksilön toimintakyky alentuu ja sairauksien sekä kuoleman riski kasvaa. Ikääntymisprosessiin vaikuttavat periytyvät komponentit ja ympäristö. Eri eliölajeilla, yksilöillä ja kudoksilla ikääntymisen etenemisnopeus on erilainen. DNA:n metylaatiolla on merkittävä rooli genomisen stabiiliuden ylläpitäjänä, solujen erilaistumisessa ja yksilön kehityksessä. Nisäkkäiden genomissa esiintyy paljon 5-metyylisytosiineja eli metyloituja sytosiineja (5mC), jotka ovat useimmiten sekvenssissä CpG. Ikääntymisen aikana CpG-kohtien metylaatiossa tapahtuu sekä sattumanvaraisesti että systemaattisen kellomaisesti käyttäytyviä metylaatiotasomuutoksia, joihin molempiin vaikuttavat ympäristö- ja geneettiset tekijät. Kellomaisessa muutoksessa metylaatiotaso nousee tai laskee hyvin lineaarisesti ajan funktiona läpi elämän. Nämä kellomaisesti käyttäytyvät metylaatiokohdat muodostavat ns. epigeneettisen kellon. Yleisesti ottaen DNA-metylaatiossa nähtävät yksilöiden väliset erot kasvavat ikääntyessä, ja metylaatio on markkeri joka kuvastaa hyvinvointia eri tasolta kuin perinteiset ikääntymisen biomarkkerit. DNA-metylaation merkittävyys vanhenemiseen liittyvässä tutkimuksessa korostuu sen vuoksi, että metylaatiotasot muuttuvat ympäristötekijöiden johdosta, ja näillä DNA-metylaatiomuutoksilla on myös kyky palautua. Kellomaisesti käyttäytyviä DNA:n metylaatiokohtia voidaan käyttää kronologisen iän estimointiin DNA-sokkonäytteestä huomattavalla tarkkuudella. Tätä epigeneettisen iän estimaattia eli epigeneettistä ikää on luonnehdittu biologisen iän mittariksi, joka voisi mahdollisesti kuvastaa ihmisten erilaista biologista ikääntymisnopeutta. Useat aiemmat tutkimukset ovat puoltaneet tätä oletusta yhdistäessään epigeneettisen iän fyysiseen toimintakykyyn, sairastavuuteen, kuolleisuuteen sekä pitkäikäisyyteen. Tutkimustavoitteet: Tässä työssä hypoteesit koostuivat seuraavista kohdista. On huomattu, että raportoiduissa ikääntymiseen liitetyissä DNA:n metylaatiokohdissa on huomattavia eroja ja tätä epäyhdenmukaisuutta oli tarpeen tarkastella (I). Tämän lisäksi DNA-metylaatioprofiilin potentiaali kuolleisuuden ennustajana yli 90-vuotiailla on ollut epäselvää, ja lisäksi sen tehokkuus perinteisiin ennustajiin verrattuna oli tarpeen arvioida (IV). Väitöskirjatutkimuksessa keskityttiin myös siihen, miten epigeneettinen ikä sekä verisolualatyyppijakaumat käyttäyvät pitkittäisseurannassa (III). Tutkimuksessa tarkasteltiin lisäksi epigeneettisen ikäestimaatin yhteyttä immuunijärjestelmän ikääntymiseen liittyviin biomarkkereihin, joita olivat sytomegalovirusinfektio (II) ja verisolualatyyppien osuuksien muutokset (III). Metodit: DNA:n metylaatiotasot mitattiin genominlaajuisella mikrosiruanalytiikalla ja tutkimushypoteesejä testattiin käyttäen muun muassa erityyppisiin regressiomalleihin ja korrelaatioon perustuvia analyysimenetelmiä. Epigeneettinen ikä estimoitiin Horvathin laskenta-algoritmillä. Aineistoina käytettiin kahta populaatiopohjaista tutkimusaineistoa, jotka yhdessä kattavat ikävuodet 15-94. Tutkimustietoa analysoitiin yhden (I, II) ja kahden aikapisteen (III, IV) perusteella. Seuranta-ajat olivat neljä tai 25 vuotta ja näytekoot vaihtelivat tutkimuskysymyksestä riippuen N=111 ja N=183 välillä. Väitöskirjatyön kaikissa osatöissä huomioitiin tutkimuksessa käytettyjen verisolunäytteiden heterogeenisyys. Tarkemmin kuvattuna, väitöskirjatyössä kartoitettiin koko epigenomin laajuisesti ikääntymiseen (I) ja suurentuneeseen kuolleisuusriskiin (IV) liittyviä yksittäisissä DNA:n metylaatiokohdissa tapahtuvia metylaatiotasojen muutoksia. Tämän lisäksi tarkasteltiin laskennallisesti määritetyn DNA-metylomi-iän (kalenteri-iän ja epigeettisen iän erotus; Δ-cAge-DNAmAge) sekä verisoluosuusjakaumien käyttäytymistä pitkittäisseurannassa (III). Väitöskirjatyössä selvitettiin myös epigeneettisen ikäestimaatin vaihtelun yhteyttä sytomegalovirusinfektioon (II) ja verisolualatyyppien osuusjakaumiin (III) sekä potentiaalia kuolleisuuden ennustajana (IV). Soluosuusjakaumien vaihtelun merkitystä koko epigenomin laajuisessa ikäassosiaatioanalyysissä analysoitiin tarkemmin peilaamalla osatyössä I paikannettuja ikäassosiaatioita ja analyysimetodeja aiemmin julkaistuihin vastaaviin tutkimuksiin. Tulokset ja johtopäätökset: Osatyössä I selvisi, että kellomaisesti käyttäytyviä DNA:n metylaatiokohtia voi havaita keski-ikäisistä koostuvassa poikkileikkaustutkimusaineistossa, jonka ikäjakauma on vain yhdeksän vuotta. Riippuen siitä oliko DNA:n metylaatiotason muutos kasvavaa vai vähenevää iän funktiona, muutokset olivat erilaisia piirteiltään, kun tarkasteltiin metylaatiokohtiin liitettyjä solun perustoimintoja tai niiden sijoittumista yksittäisiin geeneihin. Huomattiin myös, että assosiaatioanalyysien toistettavuuden kannalta oli merkittävää, että mahdollinen verisolunäytteen heterogeenisyys on huomioitu. Osatyössä IV havaittiin, että kuolleisuutta ennustava DNA-metylaatioprofiili on tehokkaampi ennustaja kuin perinteiset kuolleisuuteen ja vanhenemiseen yhdistetyt biomarkkerit. Epigeneettinen ikä ei ollut yhteydessä kuolleisuuteen ja kuolleisuutta ennustava DNA:n metylaatioprofiili erosi yleisesti tunnetuista ikääntymiseen liitetyistä DNA:n metylaatiomuutoksista. Tässä työssä selvitetty kuolleisuutta ennustava DNA-metylomin profiili tukee genomisella tasolla NF-κB-geenin roolia ihmisen elinkaaren loppupäässä. Osatyössä II huomattiin, että elämänsä aikana sytomegalovirusinfektion saaneilla tutkittavilla oli korkeampi epigeneettinen ikä verrattuna ei-infektoituneisiin tutkittaviin. Tämä tulos saattaa selittyä muutoksilla verisolupopulaatiossa, koska suuri osa eri verisoluosuuksista oli myös yhteydessä epigeneettisen iän vaihteluun (III). Merkittävimpiä DNA-metylaation variaatioon kytkeytyneitä soluosuuskorrelaatteja näyttivät olevan CD28- -tyyppiset T-solut (II, III), joita pidetään yleisesti immuunijärjestelmän kuormitustilan ja vanhenemisen markkereina. Havainnot osatyössä III osoittivat myös, että poikkileikkaustarkastelussa 90-vuotiailla verisoluosuusjakauma on selvästi erilainen kuin nuorilla aikuisilla. Seurantatuloksista nähtiin kuitenkin, että aikuisiässä ennen keski-ikää ja elinkaaren loppupäässä solualatyyppijakaumat ovat suhteellisen muuttumattomia. Tämä voisi viitata siihen, että suurin muutos solujakaumissa tapahtuu jossain keski-iän jälkeen ennen 90 vuoden ikää. Nämä tulokset korostavat entisestään verisolupopulaatioiden heterogeenisyyden huomioimisen merkitystä tämän tyyppisissä tutkimuksissa. Seurantatutkimusaineisto antoi viitteitä, että kalenteri- ja epigeneettisen iän välinen erotus (Δ-cAge-DNAmAge) muuttuu aikuisiässä suhteellisen vähän useamman vuoden tai vuosikymmenen aikana (III). Kun tähän havaintoon yhdistetään aiemmat epigeneettisen iän seurantatutkimustulokset, missä on keskitytty erityisesti lapsuusikään, vaikuttaa sille, että tämä erotus asettuu ja vakiintuu pääasialliselle tasolleen jo ennen aikuisikää. Nämä havainnot ovat ajatuksia herättäviä, koska kiihtynyt epigeneettinen ikääntyminen on liitetty kasvaneeseen kuolleisuusriskiin aikuisilla. Nämä havainnot yhdessä korostavat entisestään lapsuudessa tapahtuvien epigeneettisten muutosten merkitystä myöhemmälle terveydelle elämän aikana.Background: Aging is a continuous process, whereby the physiological integrity of an organism gradually diminishes. Eventually, disabilities in functioning evolve, and the risk of developing pathologies and death increases. The rate of aging differs between species, organisms and tissues, and inheritable components and environmental factors contribute to the aging process. DNA methylation has a critical role in genomic stability, cell differentiation and development. The genomes of mammals are abundant in 5-methylcytosines i.e. methylated cytosines (5mCs), which are primarily located in the sequence CpG. In general, the interindividual differences between genome-wide DNA methylation profiles increase with age. During aging, random as well as systematic, clocklike-behaving DNA methylation changes occur, and genetic and environmental factors contribute to these changes. Here, clocklike-behaviour refers to change where DNA methylation levels increase or decrease linearly with age, and these changes constitute the epigenetic clock. DNA methylation is a marker that disentangles details in human well-being at a more detailed level compared to conventional biomarkers. Importantly, DNA methylation has dynamic nature and is prone to the effect of environmental input. The clocklike-behaving CpG sites can be used in a sophisticated manner to estimate calendar age of “a blind sample” of DNA with a high level of accuracy. The difference between chronological age and this epigenetic age estimate (Δ-cAge-DNAmAge) is considered a highly promising biomarker of the aging rate, and many accounts of its significance in human fitness, morbidity, mortality and longevity have been reported. Aims: The specific hypotheses for this thesis comprise the following. The longitudinal within-subject behavior of Δ-cAge-DNAmAge as well as the blood cell subtype landscapes was indefinite. In addition, discrepancies in the lists of reported aging-associated methylation sites have emerged, thus requiring further evaluations. Another question concerned methylomic mortality predictors: were there DNA methylation sites that could be used as survival predictors in the elderly (+90 years of age) and could those predictors even overcome conventional biomarkers of aging in the survival analysis? Moreover, is epigenetic aging associated with biomarkers that are related to immune system aging such as the cytomegalovirus or blood cell distribution? Methods: Two study populations, the Young Finns and the Vitality 90+, together representing a wide age range (from 15 years to 94 years of chronological age) were used in the thesis. The samples were utilized in cross-sectional (Study I, II) and longitudinal (Study III, IV) manners, and the sample sizes ranged between 111 and 183 participants in Studies I-IV. The epigenomes of the participants were characterized using microarray technology-based technology, and the subjects’ DNAmAges were determined using Horvath’s calculator of epigenetic age. Blood cell compositions were determined using either DNA methylation profile-based estimation algorithm or fluorescence-activated cell sorting analysis. The hypotheses were tested using regression and correlation analyses. In the thesis, aging-associated DNA methylation level changes (I), and mortality predictors (IV) at single CpG site resolution were characterized. The longitudinal behavior of difference between calendar age and epigenetic age (Δ-cAge-DNAmAge) (III), and its role as mortality predictor (IV) were explored. Furthermore, the Δ-cAge-DNAmAge association with cytomegalovirus infection was analyzed (II). In all sections in the thesis, the role of blood cell sample heterogeneity was considered (I-IV). Specifically, the relevance of controlling sample heterogeneity in epigenome-wide association studies (EWASs) was evaluated through analysis where results from multiple studies were compared (I), the association between Δ-cAge-DNAmAge and blood cell subtype counts was explored (III), and the overall longitudinal behavior of the blood cell subtypes was investigated (III). Results and conclusions: The results from Study I highlighted that clocklike-behaving CpG site methylation may be reliably detected from a cross-sectional sample with an age range of only nine years. The data showed that aging-associated hypermethylation and hypomethylation at single CpG site resolution were related to different cellular functions and are enriched in different ways in single genes. The study underlined that, in order to obtain replicative results from EWASs with heterogenic tissue samples such as whole blood, cell count adjustment appears to be essential. In the survival analysis (IV), the mortality-predicting methylomic signature performed better than the conventional aging biomarkers and was independent from the aging-associated epigenetic drift. The methylomic prediction signature supported the genomic-level role of NF-κB at the very end of the human lifespan. In Study II, the increased epigenetic age of the blood cells was associated with latent cytomegalovirus infection in the populations of young adults and nonagenarians; however, this finding may be a reflection of changes in the blood cell composition. In studies II and III, the cell subtype counts correlated clearly with epigenetic aging (Δ-cAge-DNAmAge). The most significant correlate linked with DNA methylomic data were CD28- T cells, which are markers of immune system exhaustion and aging. The longitudinal data of blood cell composition (III) provided evidence that, in parallel with aging-associated shifts in the immune cell composition, intra-individual changes in blood cell subtype proportions are relatively small during young adulthood and middle age, as well as in the advanced age for several years or even decades. These results suggest that the major shifts in the blood cell composition might occur somewhere after middle age and before advanced ages. Thus, the blood cell composition-related issues discussed here warrant careful consideration when interpreting blood cell based results concerning individuals with varying chronological ages. Longitudinal methylomic data (III) provided evidence that the difference between chronological and epigenetic age is surprisingly stable over several years or even decades, and, when accompanied with previous reports, it may be hypothetized that the main trajectory of the blood DNA methylome aging rate (Δ-cAge-DNAmAge) is largely set before adulthood. This hypothesis is thought provoking, because older epigenetic age is also associated with increased mortality rate in adulthood. Therefore, in this light, epigenetic changes in the beginning of life gain an even more crucial meaning for the entire human lifespan