Establishment and characterisation of new human induced pluripotent stem cell lines and cardiomyocyte differentiation : a comparative view

Research background and aims. The aim of this study was to establish and characterise iPSC-lines generated with two different methods, as well as to differentiate the created cells into cardiomyocytes, maintaining a comparative view. Since traditional culture conditions include xenogenic and undefined components, also an experiment on establishing and maintaining iPSCs feeder-free was conducted. In addition to studying the reprogramming efficiency, also the expression of pluripotency genes was studied quantitatively at mRNA level. Materials and methods. iPSCs generated from patient fibroblasts were characterised by studying the expression of exogenous and endogenous pluripotency genes by PCR an RT-PCR, staining the cells with pluripotency markers, karyotyping and an embryoid body in vitro -differentiation potential assay, and RT-PCR to detect markers for each germ layer. The cardiomyocyte differentiation was performed in co-culture with END-2 cells. Pluripotency gene expression was also studied with real-time qPCR at passages 3 and 9. Results. All studied iPSC-lines except one Geltrex®-line lost at p. 9 showed successful reprogramming with no qualitative differences between sendai-virally or episomally reprogrammed lines. The lines that were cultured feeder-free stained positive for neural markers, and differentiated, neural precursor-like cells were present at all passages, which was not encountered for MEF-cultured lines. For the two cardiac-differentiated lines, the efficiency of differentiation assessed in two ways showed a more efficient differentiation of the sendai-virally reprogrammed line than the one reprogrammed with episomal plasmids. Gene expression studies showed no significant changes in pluripotency gene expression between lines or passages except for the gene NANOG, the expression of which was lower in the later passage than the earlier passage. The reprogramming efficiencies observed were extremely low, in the range of 0,005-0,017%. Conclusions. Although stem cell research is trying to generate feeder-free and xeno-free methods for iPSC generation and maintenance, the method tested in this thesis did not possess real advantages when compared to the MEF-culturing. The reprogramming efficiencies between feeder-free or MEF-cultured lines derived episomally did not differ. The pluripotency genes were already highly expressed in early passage iPSCs. The differences in pluripotency gene expression between early and late passages were small. Cardiac differentiation was more efficient for sendai-virally reprogrammed line compared to episomally differentiated line. However, more lines would be needed to verify these results. TIIVISTELMÄ Tutkielman tausta ja tavoitteet. Tämän Pro Gradu -työn tarkoituksen oli luoda ja karakterisoida kahdella eri menetelmällä uusia indusoituja pluripotentteja kantasolulinjoja, sekä erilaistaa niitä sydänlihassoluiksi END-2-erilaistusmenetelmällä vertailevalla otteella. Koska perinteiset soluviljelymenetelmät sisältävät eläinperäisiä soluja sekä tuntemattomia tekijöitä, tutkittiin myös soluvapaan Geltrex®-matriisin ja mTeSR1- kasvatusmediumin soveltuvuutta indusoitujen kantasolujen luontiin ja ylläpitoon. Lisäksi tutkittiin uudelleenohjelmoinnin tehokkuutta sekä pluripotenssigeenien aktivoitumista uudelleenohjelmoinnin alkuvaiheessa. Tutkimusmenetelmät. Luotuja kantasolulinjoja kasvatettiin yhteisviljelmissä MEF-solujen kanssa ja linjat karakterisoitiin tutkimalla eksogeenisten ja endogeenisten pluripotenssigeenien ilmentymistä PCR:n, RT-PCR:n ja määrällisesti real-time qPCR:n avulla, sekä proteiinitasolla immunovärjäämällä pluripotenssiproteiineja. In vitro -erilaistumista tutkittiin embryoid body-menetelmällä sekä tunnistamalla niistä RT-PCR:n avulla eri alkion kerrosten läsnäolo. Sydänerilaistus suoritettiin yhteisviljelmässä END-2 solujen kanssa. Tutkimustulokset. Kaikki tutkitut linjat yhtä Geltrex®:llä kasvatettua linjaa lukuun ottamatta todettiin uudelleenohjelmoituneiksi karakterisointien perusteella. Sendai-virusmenetelmällä luotu solulinja erilaistui tehokkaammin sydänlihassoluiksi kuin episomaalisilla plasmideilla erilaistettu solulinja. Soluvapaalla alustalla kasvatetut kantasolulinjat erilaistuivat spontaanisti MEF-yhteisviljelmissä kasvavia iPS-soluja enemmän, ja ilmensivät alkeellisille hermosoluille tyypillisiä proteiineja. Uudelleenohjelmoinnin tehokkuus kaikille linjoille oli matala, 0,005-0,017 %. Pluripotenssigeeniekspressiossa ei potilaiden tai eri aikapisteiden välillä havaittu merkittäviä muutoksia kuin yhdelle geenille, NANOG:lle, jonka ilmentyminen myöhemmässä vaiheessa oli alhaisempi kuin aikaisemmassa aikapisteessä. Johtopäätökset. Verrattaessa perinteistä viljelymenetelmää yhteisviljelmissä eläinperäisten MEF-solujen kanssa, tässä lopputyössä testatussa soluvapaassa menetelmässä ei saavutettu suuria etuja vaan niissä havaittiin suuria määriä erilaistuneita hermosolujen esiasteita. MEF-yhteisviljelmissä sekä soluvapaalla Geltrex®-matriisilla uudelleenohjelmoitujen iPS-solujen erilaistumistehokkuudet eivät eronneet merkittävästi toisistaan. Pluripotenssigeenit aktivoituvat jo aikaisessa vaiheessa ja ilmentymistasojen vaihtelut olivat alhaisia. Sendai-virusmenetelmällä luotu iPS-solulinja erilaistui tehokkaammin sydänlihassoluiksi kuin plasmideilla luotu iPS-linja. Koska tulokset koostuivat vain kahden linjan vertailusta, useampia linjoja tarvitaan tulosten varmistamiseksi