Evaluation of Neurotoxicity of Mercury Compounds and Aluminum in Cell Cultures

Elohopea ja alumiini ympäristömyrkkyjä, jotka ovat haitallisia aivojen toiminnalle. Pitkäaikainen altistus näille metalleille voi johtaa jopa hermosolujen tuhoutumiseen ja hermoston rappeutumissairauksiin. Ihmisten altistuminen on yleistä, sillä ympäristön saastumisen ja teollisen hyödyntämisen takia elohopeaa ja alumiinia on aina ympäristössä läsnä. Aivot on suojattu suhteellisen hyvin haitallisia kemikaaleja vastaan, mutta alumiini ja metyylielohopea pystyvät ylittämään ns. veriaivoesteen ja kerääntymään aivoihin. Ne haittaavat monia solutasoisia aineenvaihduntatoimintoja, sillä ne matkivat ja korvaavat solujen käyttämiä luonnollisia metalleja ja voivat sitoutua solun rakenneosasten kanssa. Vaikutukset kohdistuvat hyvinkin erilaisiin kohteisiin soluissa. Soluviljelmissä tutkimusolosuhteet ovat hallittavissa, ja spesifien vaikutusten arviointi eri menetelmien on mahdollista. Väitöskirjatyössä tutkittiin aivoperäisissä soluviljelmissä epäorgaanisen ja orgaanisen elohopean ja alumiinin vaikutuksia. Tutkimuskohteina olivat yleinen solumyrkyllisyys ja solukuoleman mekanismit, sekä tarkemmat solutasoiset vaikutukset. Tällaisia olivat aivojen tärkeimmän välittäjäaineen, glutamaatin, sisäänottoon liittyvät reaktiopolut, solunsisäisen kalsiumin määrä ja aivojen tukisolujen, gliasolujen, aktivaatio. Aineiden läpäisevyys veriaivoesteen läpi määrää paljolti aineen mahdollisen aivomyrkyllisyyden. Työssä kehiteltiin veriaivoesteen soluviljelymallia, jossa testattiin elohopean ja alumiinin kulkua esteen läpi. Tulokset osoittivat, että tutkittavista aineista metyylielohopea oli haitallisin kaikissa solumalleissa jo pienillä pitoisuuksilla. Lisäksi metyylielohopean vaikutus ei ollut palautuva altistuksen loputtua, kuten epäorgaanisen elohopean ja alumiinin. Alumiini ei aiheuttanut solukuolemia pienillä pitoisuuksilla, mutta merkittävä entsyymien aktivaatio oli odottamaton löydös. Aktivaatiolla voi olla merkitystä erityisesti alumiinin haittavaikutusten alkamisvaiheessa. Tutkitut metallit pystyivät aiheuttamaan soluviljelmissä hermoston tukisolujen aktivaation, joka on yleinen merkki soluvaurioista. Tukisolut ylläpitävät ihanteellista ympäristöä hermosoluille, joten tukisolujen vauriot vaikuttavat suuresti hermosoluihin. Elohopea esti glutamaatin sisäänottoa soluihin, mistä voi olla vakavia seurauksia ympäröiville soluille. Työssä kehitetty kolmen eri solutyypin veriaivoestemalli pystyi erottamaan eri elohopeatyyppien ja alumiin myrkyllisyyden. Tällainen erityisesti ihmissoluista rakennettu veriaivoestemalli on arvokas uusien kemikaalien testaamisessa. Tutkimus osoitti useita haittavaikutuksia hermostoperäisissä soluissa pitoisuuksissa, jotka ovat mahdollisia myös ihmisaltistuksissa. Metyylielohopean myrkyllisyys korostui myös siksi, että elohopea esiintyy luonnossa yleensä metyylielohopeamuodossa, joka pääsee helposti aivoihin. Alumiinin solumyrkyllisyys oli vähäisempää, mutta alumiinin aiheuttamat erityiset vaikutukset voivat olla yhtä merkittäviä ja välittää solutuhoja.Mercury and aluminum are neurotoxic metals with diverse effects on cellular functions in the brain. Ultimately exposure to them can lead to neural destruction and degenerative diseases. Although their toxic potency is now widely known, their existence in the environment and in several man-made applications makes human exposure inevitable. There are many mechanisms that cause cellular destruction with a delicate interplay with each other. That is why studies on different adverse mechanisms, and new methodological developments, as applied in this work, broaden the knowledge of the toxicity of these metals. Cell culture systems make such studies possible in strictly defined conditions. For the experiments on mercuric mercury, methylmercury and aluminum toxicity, several methods and cultures of different neural cell types were used. Cytotoxicity was evaluated in neuroblastoma, glioblastoma and retinal pigment epithelial (RPE) cell lines, with a method based on measuring the mitochondrial integrity, WST-1 assay, and the leakage of lactate dehydrogenase enzyme (LDH-test). To further characterise the mechanism of cell deaths in these experiments, induction of apoptosis, the cellular self-destruction process, was evaluated. The reactivity of glial primary astrocytes as a response to toxic insults was evaluated by measuring the amount of an intermediary filament protein, the glial fibrillary acidic protein (GFAP). The uptake of the main excitatory amino acid glutamate was studied in connection with mercury in primary RPE cells. Evaluations of protein kinase C (PKC)-linked pathways and intracellular calcium level were included to characterise the effect. For assessing how well the study metals can pass the blood-brain barrier (BBB), an in vitro BBB barrier model built on transparent membrane filters was established. Furthermore, cellular morphology was one of the aspects monitored throughout the study. The cytotoxicity studies showed that methylmercury was the most toxic substance in the sense that it exerted its effects at lower concentrations than either mercuric mercury or aluminum. The effect was seen in all culture systems. Apoptotic cell death mechanisms were involved with all metals studied, but with different cell specificity. An unexpected finding was the activation of mitochondrial dehydrogenases, especially in connection with methylmercury and aluminum at low concentrations. The activation as a toxic response may lead to equally significant consequences as deactivations seen in cytotoxicity studies. An important result was that methylmercury toxicity seemed to be irreversible. Aluminum was not very cytotoxic (did not cause cell deaths), but showed responses that may be equally important, e.g. mitochondrial activation. Formation of fibrillary structures characteristic of aluminum exposure was especially seen in glial cells, not so much in neuronal cells as had been usual in previous studies. The induction of GFAP synthesis was adapted for in vitro system. The GFAP synthesis was induced with exposure to all the metals studied. The cellular structural filaments may be a sensitive target common to many toxic metals, since mercurial compounds were as active inducers of GFAP production as aluminum. Mercuric mercury inhibited glutamate uptake in RPE cells. The inhibition was not permanent, since the uptake could mostly be restored by activating the PKC. When glutamate accumulates in the extracellular space of RPE cells, excitotoxic damages in neighbouring neuronal cells may follow. Also another major mechanism that mediates mercury toxicity was shown: Mercuric mercury could increase the intracellular calcium level rapidly from the extracellular calcium pools. Calcium is connected to several toxic cellular reactions. One of the main outcomes was that an in vitro BBB model constructed from human cells was developed. The model was able to distinguish the toxicity differences of methylmercury, mercuric mercury and aluminum. The in vitro BBB model can be adapted for the testing of new chemicals and drugs for their potency to cross the BBB and therefore exert adverse effects in the brain. As a conclusion, mercuric mercury, methylmercury and aluminum showed diverse adverse effects on neural cells. Due to accumulation, the effective concentrations may be exceeded even in human exposures. The study especially emphasised the toxicity of methylmercury, because of its wide potency and irreversibility of the effects. Furthermore, methylmercury is the form of mercury that easily enters the brain. Aluminum seemed to be less cytotoxic, but the specific effects induced by aluminum may initiate or mediate the cellular destruction as well