Cytokines and gynecological cancer.In vitro effects of cytokines on ovarian, endometrial and vulvar carcinoma cells

Sytokiinit solukasvun säätelijöinä gynekologisissa syöpäsoluissa Immunologiset mekanismit eli elimistön omat puolustusjärjestelmät ovat keskeisiä puolustautumiselle myös pahanlaatuisia soluja vastaan. Sytokiinit ovat immuunijärjestelmän tuottamia molekyylejä, joilla on kirjallisuuden mukaan todettu olevan solujen jakautumista estävää vaikutusta sekä normaaleihin soluihin että syöpäsoluihin. Useat kliiniset ja kokeelliset havainnot viittaavat siihen, että näin on tilanne myös gynekologisen syövän suhteen. Varsin rohkaisevia ovat havainnot, joiden mukaan tietyissä potilastapauksissa syöpää voidaan jopa hoitaa immuunijärjestelmän tuottamilla molekyyleillä l. sytokiineillä. Tässä väitöskirjassa, joka koostuu viidestä osatyöstä, olen tutkinut useiden kaupallisten sytokiinien vaikutusta ihmisen gynekologisten syöpäsolujen kasvuun. Tutkimuskohteena ovat munasarja-, kohdun runko-osan- ja ulkosynnytinsyöpäsolut. Kun solu valmistautuu jakaantumaan,se alkaa syntetisoimaan uutta perintöainesta eli DNA:ta.Tämä väitöskirjatutkimus keskittyy sytokiinien aiheuttamaan DNA-synteesin estoon syöpäsoluissa ja erityisesti mekanismeihin, joilla sytokiinit estävät solujen lisääntymistä. Sytokiinien mahdollisista solukasvua estävistä mekanismeista olen keskittynyt solun sisäisesti ohjelmoituun solukuolemaan (apoptoosi)ja transkriptiotekijöiden AP-1 (activating protein 1) ja NF-kB (nuclear factor kappaB) aktivoitumiseen. AP-1 ja NF-kB ovat valkuaisaineita, jotka sitoutuessaan DNA:han säätelevät monissa soluissa kasvuun ja kehittymiseen liittyvien geenien toimintaa. Sytokiinien vaikutusta syöpäsolujen lisääntymiseen tutkittiin radioaktiivisesti leimatulla uridiinilla, joka DNA:n "rakennusaineena" hakeutui solujen tumiin sitä enemmän mitä enemmän uutta DNA:ta solussa tuotettiin.Tutkimuksessa osoittautui että sytokiinit pystyvät tehokkaasti estämään DNA-synteesiä k.o. syöpäsoluissa. Ns. EMSA-testeillä (electrophoretic mobility shift assay) selvitettiin solukasvua estävien sytokiinien vaikutusta transkriptiotekijöiden aktiivisuuteen. AP-1:n havaittiin olevan aktivoituneena tumassa perussoluviljelyolosuhteissa ilman sytokiinivaikutusta kaikissa solulinjoissa. Sen aktiivisuus lisääntyi joidenkin solukasvua estävien sytokiinien vaikutuksesta kohtu- ja munasarjasyöpäsoluissa. Vaikka suoraa yhteyttä AP-1:n aktivoitumisen ja kasvua estävän vaikutuksen välillä ei voidä näillä testeillä osoittaa, on mahdollista että AP-1:lla on tärkeä rooli sytokiinien aiheuttaman kasvun eston säätelyssä. Tätä tulkintaa tukee kirjallisuudessa esiintuodut havainnot AP-1:n merkitsevyydestä solukasvun säätelijänä. Myös transkriptiotekijä NF-kB:n havaittiin olevan jatkuvasti aktivoituneena tumassa kaikissa solulinjoissa. Sitoutuminen DNA:n lisääntyi solukasvua estävän sytokiinin, ns. TNF-a:n, vaikutuksesta munasarja- ja ulkosynnytinsyöpäsoluissa. Kirjallisuuden perusteella myös NF-kB on tärkeä solukasvun säätelijä, ja on mahdollista että NF-kB osallistuu TNF-a:n vaikuttamaan solujen jakautumisen eston säätelyyn tutkituissa syöpäsoluissa Kirjallisuuden mukaan useat sytokiinit aiheuttavat apoptoosia myös pahanlaatuisissa soluissa. Ns. ohjelmoidulle solukuolemalle on tyypillistä, että kuolevassa solussa DNA pilkkoutuu lyhyiksi pätkiksi, jotka voidaan havaita, kun eripainoiset, värjätyt DNA-kappaleet kulkeutuvat sähkökentässä olevassa geelissä. Kyseisessä tutkimuksessa ainoastaan yhdessä munasarjasyöpäsolulinjassa todettiin spontaania apoptoosia, jota interferoni gamma kykeni vähentämään. Kirjallisuuden mukaan NF-kB kykenee estämään apoptoosia. Tämä ilmiö voi hyvinkin selittää solukasvua estävien sytokiinien kykenemättömyyden aiheuttaa apoptoosia tutkituissa syöpäsoluissa. Sytokiinien kasvua säätelevästä vaikutuksesta erityisesti ulkosynnytinsyövässä on hyvin vähän aienpaa tietoa. Myöskään solukasvua säätelevien transkriptio- tekijöiden toimintaa gynekologisissa syöpäsoluissa on vähän aiemmin tutkittu ja siksi kyseinen väitöskirjatyö tuo uutta tietoa näiden syöpien biologiasta. Ko. projektilla saattaa olla konkreettisia kliinisiä sovelluksia ajatellen pahanlaatuisten solumuutosten biologiaa ja syövän hoitoa. Immunologisten säätelymolekyylien (sytokiinien) osuus esim. perinteisten syöpähoitojen tukena gynekologisessa syövässä saattaa lähitulevaisuudessa olla merkittävä.Numerous investigations show that cytokines have a significant role in the regulation of cell growth. In addition, programmed cell death has been found to be induced by cytokines in numerous cell types. There is also increasing evidence for the role of transcription factors in the cytokine-mediated growth-regulation of cancer cells. This dissertation was undertaken to evaluate the significance of several cytokines as growth-regulatory factors in ovarian, endometrial and vulvar carcinoma cells in vitro. The effect of cytokines on DNA synthesis was measured by 125I-deoxyuridine (125IUdR) incorporation assay. In order to better understand the molecular mechanisms of the observed effects, the activation of DNA-binding proteins AP-1 and NF-?B was studied by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). In addition, cellular DNA was extracted to determine if the most growth-inhibitory cytokines were able to induce apoptosis. Our results showed that IFNs, IL-10, TGF-?, TNF-? and GM-CSF are primarily growth inhibitory factors in ovarian, endometrial and vulvar carcinoma cells. IL-13 was also able to inhibit cell proliferation in vulvar and endometrial carcinoma cells. Transcription factors NF-?B and AP-1 were constitutively activated in all cell lines studied. The binding activity of NF-?B was found to be further stimulated by TNF-? in vulvar carcinoma cells whereas activity of NF-?B was decreased by IL-10 and IL-13 in UM-SCV-1A cells. The binding activity of NF-?B was found to be increased by TNF-? in UT-OC-3 and UT-OC-5 cell lines, while in UT-OC-2 endometrioid ovarian carcinoma cells the activity of NF-?B was found to be stimulated by IFN-?. The binding activity of AP-1 was found to be stimulated by all growth-inhibitory cytokines studied in UT-OC-5 ovarian and UM-EC-3 endometrial carcinoma cell-lines. In UT-OC-3 ovarian carcinoma cells, the binding activity of AP-1 was found to be stimulated by growth-inhibitory cytokines TGF-? and TNF-?. ?o effect on AP-1 was found by any of the cytokines in vulvar carcinoma cells. Growth-inhibitory TNF-?, TGF-?1, IFN-? and IFN-? were able to stimulate the activity of AP-1 in UT-OC-2 cells. In all experiments, with the exception of the UT-OC-2 cell line, the electrophoretic analyses after cytokine challenge showed intact DNA, and no signs of DNA fragmentation, a feature typical of programmed cell death, were observed in any of these analyses. DNA extracted from the UT-OC-2 ovarian carcinoma cells showed fragmentation as a sign of apoptosis under basal culture conditions. IFN-? was found to inhibit apoptotic response whereas TNF-? and TGF-? showed no effect. The findings of the present study suggests that AP-1 and NF-?B may play a role in regulating of cell proliferation and apoptosis in gynecological carcinoma cells studied. However, it is possible that rather than being specialized mediators of proliferative, antiproliferative or apoptotic responses to exogenous stimuli, these transcription factors may play a general role in signal transduction from the membrane to the nucleus by interacting directly or indirectly with other factors. The role of cytokines, especially in endometrial and vulvar carcinoma, is poorly understood and therefore the present study offers new knowledge of the action of immunomodulatory factors in gynecological carcinoma cells. Although the results of the present study cannot be compared directly to in vivo situations, this in vitro study has a significance since recently characterized and low passage cell lines have been used. The enhanced understanding of the function of cytokines and increasing availability of recombinant cytokines may have important implications for novel therapeutic approaches in the future, especially for malignancies thus far having limited therapeutic options, e.g. ovarian carcinoma