Development of human stem cell culture conditions for clinical cell therapy

Erilaistumattomien kantasolujen erityispiirteitä ovat lähes rajaton jakautumiskyky sekä kyky erilaistua moniksi erilaistuneiksi solutyypeiksi. Näiden erityispiirteiden ansiosta kantasoluja voidaan hyödyntää sekä tutkimuksessa että regeneratiivisessa lääketieteessä. Pluripotentit kantasolut, kuten ihmisen alkion kantasolut ja indusoidut pluripotentit kantasolut, pystyvät erilaistumaan ainakin teoriassa miksi tahansa aikuisen yksilön solutyypiksi kun taas monikykyisillä aikuisen kantasoluilla on rajallinen jakaantumis- ja erilaistumiskyky, jolloin ne voivat muodostaa erilaisia solutyyppejä tietyn solulinjan sisällä. Aikojen kuluessa kantasoluja on viljelty monissa erilaisissa olosuhteissa. Tällä hetkellä yleisesti käytössä olevissa kantasolujen johtamis-, viljely-, ja erilaistamistekniikoissa käytetään eläinperäisiä ainesosia. Kliinisessä käytössä eläinperäiset ainesosat voivat aiheuttaa vakavan immunivasteen, viruksien ja bakteerien aiheuttamia infektioita, prionitauteja sekä toistaiseksi tunnistamattomia eläintauteja. Tässä työssä tutkittiin automatisoidun viljely-, kuvantamis- ja analyysimenetelmän soveltuvuutta erilaisissa viljelyolosuhteissa kasvatettujen erilaistumattomien ihmisen alkion kantasolujen kasvudynamiikan evaluoimiseksi. Lisäksi työssä tutkittiin alhaisen happipitoisuuden vaikutuksia ihmisen alkion kantasolujen uusiutumis- ja erilaistumiskykyyn sekä niihin vaikuttavia molekyylitason mekanismeja. Edelleen koostumukseltaan tunnettuja ja eläinperäisiä ainesosia sisältämättömiä kantasolujen viljelyolosuhteita evaluoitiin, kehitettiin ja optimoitiin täyttämään Euroopan Unionin direktiivien asettamat viranomaisvaatimukset kantasolujen kliinisistä sovelluksista. Työssä evaluoitiin koostumukseltaan tunnetun, eläinperäisiä ainesosia sisältämättömän viljelyliuoksen soveltuvuutta ihmisen alkion kantasolujen perustamisessa ja viljelyssä sekä indusoitujen kantasolujen ja aikuisen kantasolujen viljelyssä. Tämän työn tulokset osoittavat, että automatisoitu viljely-, kuvantamis- ja analysointimenetelmä mahdollisti erilaisissa viljelyolosuhteissa kasvatettujen erilaistumattomien ihmisen alkion kantasolujen kasvudynamiikan analysoinnin luotettavasti, tuottaen enemmän informaatiota kuin perinteinen mikroskooppinen tarkastelu. Alhainen happipitoisuus esti ihmisen alkion kantasolujen spontaania erilaistumista, tuki uusiutumiskykyä ja lisäsi merkittävästi jakaantumista. Alhaisessa happipitoisuudessa olennaisia eroja esiintyi alhaisen happipitoisuuden, kalsium ja PKC ja retinolihapon signaalireiteille keskeisten geenien ilmentymisessä erilaisissa viljelyolosuhteissa. Yhtä uusiutumiskyvylle merkittävää transkriptiotekijää Oct-4:sta ilmentyi merkittävästi enemmän alhaisessa happipitoisuudessa, osoittaen mahdollisen mekanismin alhaisen happipitoisuuden indusoimalle uusiutumiskyvyn lisääntymiselle ja spontaanin erilaistumisen estämiselle. Tämän työn tulokset osoittavat, että useat eläinperäisiä ainesosia sisältävät viljelyliuokset eivät pystyneet ylläpitämään ihmisen alkion kantasolujen erilaistumatonta kasvua. Osa ihmisen alkion kantasoluista kuitenkin kykeni adaptoitumaan ihmisen seerumia sisältävään viljelyolosuhteeseen. Tässä työssä kehitetty koostumukseltaan tunnettu ja eläinperäisiä ainesosia sisältämätön viljelyliuos RegES mahdollisti ihmisen alkion kantasolulinjojen perustamisen. Lisäksi RegES viljelyliuos mahdollisti ihmisen alkion, indusoitujen ja aikuisen kantasolujen pitkäaikaisen viljelyn, kantasolujen tehokkaan jakautumisnopeuden sekä ylläpiti kantasolujen erityispiirteitä ja erilaistumiskykyä. Parhaillaan kantasoluja hyödyntäviä kliinisiä soluterapiakokeita on jo käynnissä, mikä edellyttää keskittymistä erityisesti laboratorio-olosuhteissa lisättyjen solusiirteiden turvallisuuteen ja laatuun. Käyttämällä koostumukseltaan tunnettuja eläinperäisiä ainesosia sisältämättömiä tuotteita voidaan solutuotteiden turvallisuutta ja laatua parantaa merkittävästi. Koostumukseltaan tunnettujen olosuhteiden käyttö mahdollistaa kantasolujen säätelyn ja erilaistumisen syvempää ymmärtämistä sekä lisää tulosten toistettavuutta ja luotettavuutta. Viljelyolosuhteilla voi olla huomattavia vaikutuksia solujen erityispiirteisiin, jonka vuoksi solujen asianmukainen karakterisointi tarkoin määritellyillä analyysimenetelmillä on ensiarvoisen tärkeää. Tulevaisuudessa pitäisi keskittyä eläinperäisiä ainesosia sisältämättömien viljelyolosuhteiden validoimiseen ja osoittaa, että ne mahdollistavat solujen pitkäaikaisen viljelyn, ylläpitävät uusiutumiskyvyn erityispiirteitä, erilaistumiskykyä ja geneettistä stabiiliutta, mahdollistavat uusien kantasolulinjojen perustamisen, uudelleenohjelmoinnin ja eristämisen, sekä tuotannon lisäyksen. Täydentäviä prekliinisiä turvallisuus- ja tehokkuustutkimuksia tarvitaan vielä ennen kuin eläinperäisiä ainesosia sisältämättömien tuotteiden kaikki hyödyntämismahdollisuudet voidaan toteuttaa. Tämä työ osoittaa, että eläinperäisiä ainesosia sisältämätön viljelyliuos RegES soveltuu erilaisten kantasolujen perustamisen, viljelyn ja erilaistamisen jatkokehitykseen ja voi tulevaisuudessa toimia perustana kliinisten monikykyisten ja pluripotenttien kantasolujen sekä näiden johdannaisten turvallisessa tuotannossa kliinisiä soluterapiahoitoja varten.The hallmark of all undifferentiated stem cells is their nearly unlimited self-renewal capacity and their potential to differentiate into a diverse range of specialised cell types. These unique properties of stem cells make them invaluable research tools and can potentially serve as a source of cells for regenerative therapies. Pluripotent stem cells such as human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) are capable of producing almost any cell type in the human body, whereas multipotent adult stem cells exhibit limited self-renewal and a differentiation capacity that is restricted to the cell types of a particular lineage or a closely related family of cells. Since the discovery of stem cells, diverse culture conditions have been evaluated for different types of stem cells. In current standard in vitro cell culture techniques, xenogeneic reagents are used in the establishment, cultivation, and differentiation procedures. For the clinical a! pplications of stem cells, however, xenogeneic reagents pose the risk of a severe immune response, and the transmission of viral or bacterial infections, prions, and unidentified zoonoses. In this study, we assessed the applicability of an automated cell culturing, imaging, and analysis system to evaluate undifferentiated growth dynamics of hESCs maintained in different culture media. The molecular mechanisms regulating self-renewal and pluripotency of hESCs under hypoxic conditions were also elucidated. Furthermore, defined and xeno-free culture conditions for the expansion of stem cells were evaluated, developed, and optimised to meet the regulatory standards set by the directives of the European Union for the clinical application of stem cells. The applicability of a defined xeno-free medium for the derivation and maintenance of hESCs as well as for the expansion of iPS cells and adipose stem cells (ASCs) was evaluated. The results indicated that the automated cell culturing, imaging, and analysis system enables reliable analysis of the undifferentiated growth dynamics of hESCs in different culture conditions, and revealed more information than does conventional microscopic observation. Exposure to hypoxic conditions prevented spontaneous differentiation, supported self-renewal, and significantly increased the hESC proliferation. Fundamental differences in genes that are central to hypoxia signalling, calcium and PKC pathway, and the retinoic acid pathway were detected in different culture conditions under hypoxia. A key transcription factor for self-renewal, Oct-4, was significantly upregulated under hypoxic conditions, indicating a possible mechanism for hypoxia-induced self-renewal and prevention of spontaneous differentiation. The results of these studies suggest that although a population of hESCs was able to adapt to human serum-containing culture conditions, several of the xeno-free culture media evaluated were unable to maintain hESC self-renewal. Here we developed a xeno-free medium formulation, RegES, that allowed for the derivation of pluripotent hESC lines. Furthermore, hESCs, iPS cells, and ASCs can be propagated in the RegES medium for a prolonged period of time with a reasonable proliferation rate while maintaining their characteristics and differentiation potential. Clinical stem cell therapy trials are ongoing, which calls for a strong focus on the safety and quality of in vitro expanded stem cell transplants. By replacing xenogeneic products with a defined xeno-free medium, the safety and quality of the cells with therapeutic potential may be enhanced significantly. The use of completely defined conditions will allow for a better understanding of stem cell regulation and differentiation as well as provide more reproducible and reliable results. Culture conditions may have significant impact on the cell characteristics, thus proper characterization of cells with specific analyzing methods is necessary. Future studies should focus on validating the xeno-free culture conditions to demonstrate the ability for long-term culture, maintenance of key features of self-renewal, differentiation potency, and genetic stability, as well as derivation, reprogramming, or isolation of new stem cell lines as a full proof-of-principle, and to provide for scale-up to a manufacturing level. Additional pre-clinical safety and efficacy studies are needed before the promise of the xeno-free products can be fully realised. The results of the present study indicate that the xeno-free RegES medium is applicable for further optimization of xeno-free establishment, culture, and differentiation of various stem cell types and can ultimately serve as a platform for the production of clinical-grade multi- and pluripotent stem cells and their derivatives for safer clinical cell-based therapy