Mejora genética de cepas de Streptomyces coelicolor parala producción de metabolitos secundarios mediante el estudio de su regulación por sistemas de dos componentes

Tesis llevada a cabo para conseguir el grado de Doctor por la Universidad de Salamanca.--2018-09-27Streptomyces es un género de bacterias Gram positivas cuyo hábitat principal es el suelo y que es especialmente valorado por su importancia como productor tanto de enzimas como de compuestos bioactivos (antibióticos, antitumorales, antifúngicos…). La utilización de técnicas de ingeniería genética que permitan estudiar y actuar sobre las complejas redes regulatorias de estos productos para mejorar su síntesis es una de las aproximaciones empleadas para obtener nuevos compuestos con este tipo de actividades, así como para mejorar su producción. Los sistemas de dos componentes son la principal vía de señalización de bacterias: se componen de una histidina quinasa responsable de captar un determinado estimulo y un regulador de respuesta, y están relacionados tanto con producción de metabolitos secundarios como con diferenciación morfológica. De esta manera su eliminación o sobreexpresión puede ayudar a generar cepas que produzcan mayores cantidades de dichos compuestos, tanto propios como expresados de forma heteróloga. Durante este trabajo se ha generado una batería de 21 mutantes de Streptomyces coelicolor, la especie más estudiada del género, en dos sistemas de dos componentes (AbrA y AbrB) y una histidina quinasa (AbrC1) (Yepes et al., PLoS One 2011; 6(5): e19980). Para la obtención de estos mutantes, se ha puesto a punto un sistema de mutación CRISPR-Cas9 que nos ha permitido obtener importantes mejoras tanto en eficiencia como en tiempo de obtención de mutantes, que además carecen de marcadores de resistencia. Una vez obtenidos los mutantes planteados (mutantes sencillos, dobles y triples, sobre las cepas de S. coelicolor M145, y sus derivados M1146 y M1154) (Gómez-Escribano y Bibb, Microbial Biotechnology 2011 Mar; 4(2): 207–215), estos fueron usados para producir de forma heteróloga diferentes metabolitos secundarios de interés. Si bien los resultados muestran lo ventajoso de usar algunas de las cepas parentales empleadas en este estudio, varios de los datos obtenidos apuntan a que sería necesario incluir además otro tipo de aproximaciones para solucionar algunos problemas surgidos. De otra parte, también se han llevado a cabo diferentes aproximaciones que incluyen técnicas de secuenciación masiva. Aquí se incluyen la secuenciación y comparación genética de algunas de las cepas empleadas, que muestran interesantes diferencias tanto entre ellas como con el genoma de referencia de S. coelicolor publicado (Bentley et al., Nature. 2002 May 9;417(6885):141-7), y también experimentos de RNA-Seq. Estos últimos se realizaron para tratar de profundizar en los mecanismos de regulación de dos de los sistemas de dos componentes (AbrA y Aor1) por medio del estudio de las diferencias de expresión génica con respecto a la cepa silvestre M145. Dichos experimentos han permitido obtener información de gran importancia, apoyando experimentos previos y profundizando en la relación del sistema AbrA en procesos de captación y aprovechamiento de hierro, y apuntando a una probable implicación del regulador de respuesta Aor1 con respuestas a estrés osmótico, además de alteraciones importantes en el metabolismo secundario en ambos casos (Antoraz et al., Frontiers in Microbiology 2017; 8: 2444).La presente tesis doctoral ha sido desarrollada en el Instituto de Biología Funcional y Genómica (IBFG), centro de investigación mixto de la Universidad de Salamanca y el CSIC, gracias al apoyo económico por parte de la Junta de Castilla y León y el Fondo Social Europeo con la concesión de una beca predoctoral (ORDEN EDU/310/2015), y a través de los proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad (Mineco) (PCIN-2014-067, convocatoria ERA-IB2, y BIO2015-66958- R).Peer reviewe