Identificación y análisis funcional de Inc-Spry1 como regulador temprano de la EMT: desarrollo de una nueva metodología para la generación de genotecas de esponjas anti-small RNAs

Trabajo presentado por Doña Cristina Rodríguez Mateo, para optar al Grado de Doctor en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación clínica por la Universidad de Sevilla, y que ha sido realizadoen el Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa.Se estima que el 98% de los productos transcritos del genoma humano representa RNA que no codifica proteínas. Hasta hace relativamente poco, las moléculas de RNA no codificante se consideraban RNA basura, RNA sin ninguna función biológica. Sin embargo, el descubrimiento de la implicación de miles de estas moléculas en un amplio rango de procesos biológicos, incluyendo proliferación, diferenciación y desarrollo, así como una gran variedad de enfermedades, ha originado un creciente interés de la comunidad científica en investigar la función de las moléculas de RNA no codificante. En lo que a tumorigénesis se refiere, dichas moléculas se perfilan actualmente como potenciales biomarcadores con un importante impacto en la diagnosis, prognosis y predicción de respuesta a tratamientos. Uno de los procesos asociados con tumorigénesis, principalmente con metástasis, es la transición epitelio-mesénquima (EMT). Las células cancerígenas pueden experimentar un proceso de EMT para escapar del tumor primario, invadir los tejidos contiguos y colonizar sitios remotos, viajando a través del torrente sanguíneo o los vasos linfáticos y generando metástasis. Además de la conocida reprogramación transcripcional que tiene lugar durante la EMT, hay una serie de mecanismos post-transcripcionales de gran importancia en la regulación de dicho proceso, entre los cuales se encuentran la regulación del splicing alternativo de pre-mRNAs y la regulación génica mediada por moléculas de RNA no codificantes. Aunque se han estudiado y caracterizado numerosos miRNAs que controlan la EMT, hasta la fecha son pocos los lncRNAs identificados que participan en la regulación de dicho proceso y se desconoce la posible función que podrían realizar como reguladores tempranos de la EMT. Los lncRNAs son transcritos menores de 200 nucleótidos con un limitado potencial codificante que pueden actuar como cebo, guía, andamio, potenciadores de la transcripción, etc, en todos los niveles de regulación génica, en un amplio rango de procesos biológicos. En esta tesis se describe la identificación de un lncRNA de ratón mayoritariamente nuclear y adyacente al gen Spry1, nombrado por ello lnc-Spry1, cuya expresión disminuye de forma temprana en células NMuMG tratadas con TGF-β. El silenciamiento de lnc-Spry1 induce un fenotipo pseudomesenquimal y un aumento de la migración e invasividad celular, además de producir cambios de expresión principalmente en genes regulados a su vez por TGF-β. La depleción de la proteína Smad4 afecta a la bajada de expresión de lnc-Spry1 al tratar las células NMuMG con TGF-β, lo que indica que lnc-Spry1 podría ser una diana directa de la ruta de señalización de las Smads. En cuanto a su mecanismo de acción, se demuestra la interacción de lnc-Spry1 con U2AF65, un factor auxiliar de splicing. Además, el silenciamiento de lnc-Spry1 induce un cambio de isoformas de los receptores FGFR dando lugar a célulassensibles a FGF2, cambio de isoformas que se produce también al tratar las células con TGF-β. En conjunto, estos resultados indican que lnc-Spry1 modula de forma temprana la expresión y el splicing alternativo de genes implicados en la EMT. Finalmente, se describe el diseño y optimización de una nueva metodología para generar genotecas de esponjas anti-small RNAs para la realización de escrutinios funcionales masivos con objeto de identificar moléculas de RNAs pequeños no codificantes (sncRNAs) supresores tumorales. Usando dicha metodología se generaron moléculas esponja contra miR-21 y se demostró su eficiencia. Esta nueva y potente tecnología permitirá la identificación de nuevos sncRNAs implicados en distintos procesos biológicos de forma eficiente y asequible, y describe por primera vez un procedimiento que permite la generación de genotecas de esponjas correspondientes a poblaciones completas de RNAs pequeños de tejidos, órganos o células seleccionados por su posible interés en algún proceso biológico o patología.Peer Reviewe