Empleo de mutaciones activadoras de la proteína glucoquinasa en la terapia génica-celular de la diabetes Mellitus

Trabajo de Investigación para optar al grado de Doctor por la Universidad Pablo de Olavide de Sevilla, Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica.La Diabetes Mellitus, está considerada por la OMS, como una enfermedad crónica que aparece cuando, el páncreas no produce la suficiente insulina o el organismo del paciente no la utiliza eficazmente produciendo una hiperglucemia en el enfermo. Actualmente la padecen el 8,3% de la población mundial (http://www.idf.org/diabetesatlas; Soriguer et al., 2012). Las complicaciones de la diabetes hacen que el riesgo de muerte de estos pacientes se duplique frente a individuos sanos y que la enfermedad lleve asociado un alto gasto sanitario. Las dos formas más habituales de diabetes son la tipo 1 (DM1) (5-10%) y la tipo 2 (DM2) (90-95%). La primera es de origen autoinmune y en ella se produce una completa destrucción de las células ß pancreática. En la tipo 2 existe un daño de las células ß, que produce una alteración en la secreción de insulina y una resistencia a la insulina. En su origen intervienen factores genéticos y medioambientales. El tratamiento de la DM2 pasa por el empleo de fármacos secretagogos, de moléculas que disminuyen la resistencia a la insulina y cuando es necesario la administración exógena de insulina. En el caso de la DM1 esta es la única opción. En la última década, el trasplante de islotes pancreáticos ha demostrado ser una alternativa exitosa para el tratamiento de la diabetes, sin embargo la escasez de donantes cadavéricos y la dificultad en obtener suficientes islotes de los donantes han hecho que se busquen otras alternativas para obtener fuentes renovables de células ß (Soria et al., 2008). En este sentido, la diferenciación de células troncales (embrionarias y adultas) hacia células productoras de insulina podría ser una opción. Sin embargo, todavía no se ha obtenido un éxito completo. Probablemente, eso se deba a que las células ß son más eficientes cuando actúan en cooperación con las otras células que forman parte de los islotes pancreáticos, indicando que la arquitectura funcional de los islotes es esencial para una adecuada liberación de insulina en respuesta a nutrientes (Soria et al., 2010). Por lo tanto, si se quiere conseguir un control fisiológico de la glucemia, deberíamos contemplar como interesante la posibilidad de mejorar los islotes obtenidos de donantes, para tratar de mejorarlos previamente a ser trasplantados, en lugar de centrarse únicamente en obtener células ß aisladas. La Hexoquinasa IV conocida como Glucoquinasa, es una proteína que se expresa principalmente en la célula ß y en el hígado (Matschinsky and Porte, 2010) y está directamente relacionada con el control de la homeostasis de la glucosa en el organismo, siendo la principal responsable de la secreción de insulina (Iynedjian, 1993; Matschinsky et al., 1993; Printz et al., 1993). Estudios recientes en humanos, han descrito diversas mutaciones en la proteína glucoquinasa. Su carencia o mal funcionamiento produce déficit en la secreción de insulina, provocando hiperglucemias, mientras que mutaciones activadoras tienen el efecto opuesto, ya que generan hipoglucemias e hiperinsulinemias, siendo necesaria una pancreatoctomía parcial o total en los pacientes (Andrikopoulos et al., 2000; Davis et al., 1999; Fajans et al., 2001; Gloyn, 2003; Njolstad et al., 2001; Postic et al., 1999). Ya que las mutaciones activadoras de la glucoquinasa parecen inducir, en los pacientes, una secreción de insulina mayor que la de la proteína silvestre (Cuesta-Munoz et al., 2004; Christesen et al., 2008), en este trabajo, se plantea la posibilidad de usarla para la mejora de los islotes pancreáticos previo a su trasplante y así disminuir el número de islotes pancreáticos necesarios por paciente. Entre las mutaciones activadoras de la glucoquinasa la denominada V91L, resulta ser una de las mejor caracterizadas a nivel clínico en los pacientes (Kassem et al., 2010). Así pues, el objetivo de este proyecto es la expresión de laglucoquinasa mutante V91L en islotes pancreáticos de ratón y humanos y ver si estos islotes presentan características similares a las descritas en los pacientes. Esto permitiría usar estos islotes de un modo más eficaz en la terapia celular de la diabetes. Para ello, se han generado vectores lentivirales, que nos permitan inducir la expresión de la glucoquinasa silvestre y mutante (V91L), en los islotes pancreáticos de manera estable y sin comprometer la integridad de los mismos. Tras la inducción de la expresión se analizaron los efectos que la expresión de la mutación activadora de glucoquinasa V91L produce en los islotes pancreáticos. Se realizaron estudios de tamaño, secreción, proliferación y apoptosis en dichos islotes una vez infectados con los distintos vectores virales. Para la realización de este trabajo, se utilizaron tanto islotes provenientes de ratón, como de donantes cadavéricos humanos. Se cultivaron los islotes en presencia de los distintos vectores virales, y en ausencia de los mismos como control, para posteriormente someterlos a las distintas técnicas de análisis según el parámetro que se deseara estudiar. De esta manera se midió tanto la capacidad de secretar insulina de los islotes, como la concentración de glucosa a la que se producía la misma, reproduciéndose en el caso de los islotes que se infectaron con la proteína mutante el fenotipo observado en los pacientes. También se analizaron la proliferación y apoptosis de los islotes, mediante técnicas de inmunofluorescencia, en las que se detectaron y cuantificaron las células de los islotes que presentaban roturas de doble cadena en su ADN, para cuantificar la apoptosis, y aquellas células que expresaban el marcador de proliferación Ki67, para cuantificar la misma. Se comprobó que los islotes infectados, que expresaban la proteína glucoquinasa mutante V91L, reproducían, casi en su totalidad, el fenotipo de islotes estudiado en los pacientes portadores de dicha mutación.Las conclusiones de los resultados obtenidos son las siguientes: 1.Se consiguió la formación de lentivirus que expresaran la glucoquinasa silvestre y mutante (V91L) y fueran capaces de infectar islotes de ratón y humanos. 2.La expresión de la glucoquinasa silvestre o mutada (V91L) tras la infección no produce cambios en el tamaño o forma de los islotes infectados. 3.Los islotes infectados, que expresan la glucoquinasa silvestre no ven afectada su capacidad de secretar insulina, ni el umbral de glucosa necesario para ello. 4.Los islotes infectados con lentivirus que expresarán la glucoquinasa mutante V91L, presentan un umbral de glucosa para la secreción de insulina inferior al umbral fisiológico, y una mayor capacidad de secretar insulina que el resto de condiciones de estudio. 5.La infección de los islotes afecta a la viabilidad de estos sin importar el lentivirus con que sean infectados, aunque hay un aumento significativo (p<0.001) en la apoptosis de los islotes infectados con la glucoquinasa V91L. 6.Los análisis en la proliferación nos indican que esta no se ve afectada por la infección lentiviral. 7.La expresión de la glucoquinasa mutada V91L tras la infección produce un incremento significativo (p