Determination of NADH using carbon paste electrodes modified with electropolymerized films of 3,4-dihydroxybenzaldehyde

O processo de eletropolimerização do 3,4 diidroxibenzaldeído (3,4-DHB) sobre eletrodos de pasta de carbono foi estudado utilizando voltametria cíclica e deposição a potencial controlado. As características dos filmes eletropolimerizados foram altamente dependentes do pH, potencial anódico de inversão de varredura, velocidade de varredura, concentração de 3,4-DHB e número de ciclos usados durante o processo de formação. A estabilidade dos filmes foi determinada em tampão citrato/fosfato no mesmo pH usado durante o processo de eletropolimerização. Os melhores resultados foram obtidos utilizando-se voltametria cíclica nas seguintes condições de trabalho: pH 7,8; 0,25 mmol L-1 de 3,4-DHB; 10 mVs-1; 10 ciclos e 0,0 ≤ Eapl ≤ 0,25 V. O processo de eletropolimerização foi totalmente inibido na presença de soluções de 3,4-DHB contendo NADPH e parcialmente inibido na presença de NADH. Deste modo, a formação do radical livre fenoxil, para o qual o NADPH é, em sistemas biológicos, um agente supressor mais efetivo do que o NADH, sendo responsável pela etapa inicial do processo de formação do filme. Estes resultados permitiram concluir que não é possível, durante este processo, imobilizar enzimas ou co-fatores enzimáticos (NADH ou NADPH). A superfície modificada foi rapidamente destruída após exposição a soluções de NADPH. Desde modo, a oxidação catalítica dos co-fatores pode envolver os grupos fenólicos presentes no filme modificador, de acordo com o mecanismo de eletropolimerização proposto neste trabalho. Os eletrodos modificados foram utilizados, durante 3 dias, para determinação amperométrica de NADH a 0,23 V (vs Ag/AgCl, KCl sat), obtendo-se resposta linear no intervalo de 0,015 ≤ [NADH] ≤ 0,21 mmol L-1. NADH foi igualmente determinado usando-se sistema de análise por injeção em fluxo (FIA). As condições otimizadas foram: alça de amostragem com volume 100 µL e vazão de 0,7 mL min-1. As amostras de NADH foram preparadas em solução tampão PIPES 0,01 mol L-1 (pH 6,8), enquanto o fluído transportador utilizado foi solução 0,01 mol L-1 de tampão fosfato, pH 6,8. Resposta linear foi observada no intervalo de 0,005 ≤ [NADH] ≤ 0,15 mmol L-1, com limite de detecção estimado em 0,4 µmol L-1 (3S/R) e freqüência analítica de 55 determinações/hora.Cyclic voltammetry and deposition at controlled potential were used to study the 3,4-dihydroxybenzaldehyde (3,4-DHB) electropolymerization process at carbon paste electrode surfaces. The electropolymerized film characteristics were highly dependent on pH; anodic switching potential; scan rate; 3,4-DHB concentrations and scan numbers. The film stability was determined in citrate/phosphate buffer solutions at the same pH used during electropolymerization process. The best films were obtained by using cyclic voltammetry at the conditions: pH 7.8; 0.0 ≤ Eapl ≤ 0.25 V; 10 mVs-1; 0.25mmolL-1 3,4-DHB and 10 scans. The electropolymerization process was totally inhibited in presence of NADPH and partially inhibited in presence of NADH containing solutions. Since NADPH is a known phenoxyl radical scavenger in biological systems, the fenoxyl free radical was the responsible specie for the initial step in the electropolymerization process. From these results were concluded that it is not possible to immobilize enzymes or co-factors (NADH and NADPH) during the electropolymerization process. The modified surface was quickly lost after use in NADPH solutions, but showed upper stability in NADH solutions. These results were indicative that NADPH and NADH catalytic oxidations could be involve the phenolic groups present in the electropolymerized film as described by the mechanism proposed in this work. The modified electrodes could be used during three days to the amperometric NADH determinations, at 0.23 V (vs Ag/AgCl, KCl sat), with linear response in 0.015 mmol L-1 ≤ [NADH] ≤ 0.21 mmol L-1 range. The analite was also determined in flow injection systems (FIA) by using loop size of 100 µL and flow rate of 0.7 mL min-1. NADH solutions were prepared in 0.01 mol L-1 PIPES byffer solution, pH 6.8 while the carrier stream was phosphate buffer solution 0.01 mol L-1, pH 6.8. Linear response was observed in 0.005 mmol L-1 ≤ [NADH] ≤ 0.15 mmol L-1 range, with detection limit of the 0.4 µmol L-1 (3S/R) and analytical frequency of 55 determinations/hour