Preparation of peptide esters by solvolysis and aminolysis of Ca2+ assisted peptidyl resins of kaiser resins

O objetivo do presente trabalho foi propor e estabelecer um novo método de preparação de peptídeos protegidos &#945;-esterificados. Para tal, investigamos inicialmente o efeito da presença de HAc, Ca(OAc)2 e mistura de ambos na eficiência de metanólise de Ac-Ala-Gly-X-KOR (onde, X= Gly, Ala ou Phe) em DCM. Surpreendemente, as reações assistidas por Ca2+ forneceram os produtos esterificados desejados com os mais altos rendimentos. Com base nestes dados comparamos as eficiências das reações de metanólise de Ac-Ala-Gly-X-KOR [onde, X= Lys(2-Cl-Z), Phe, Ala ou Gly] asssistidas pelo íon cálcio. Estas se mostraram dependentes da natureza do resíduo C-terminal ligado à resina, pois os rendimentos de desligamento peptídeo da KOR obtidos para as reações de 6 horas apresentaram a seguinte ordem: Lys(2-Cl-Z)< Phe <Ala < Gly. Após 48 h, os rendimentos foram superiores a 68%. A possibilidade de preparar Ac-Ala-Gly-X-OEt [onde, X= Lys(2-Cl-Z) ou Ala] usando o mesmo procedimento foi também investigada. Ac-Ala-Gly-Ala-OEt e Ac-Ala-Gly-Lys(2-Cl-Z)-OEt foram produzidos com 69 e 24% de rendimento em 72h a 37ºC, respectivamente. Quando DCM foi substituído por DMSO ou 25%DMSO/tolueno a 55ºC, houve um aumento significativo nos rendimentos de etanólise da Ala-Gly-Lys(2-Cl-Z)-KOR. Benzólise e tiólise de Ac-Ala-Gly-X-OEt (onde, X= Lys(2-Cl-Z)ou Ala] foram testadas. As análises de aminoácidos das peptidil-KOR residuais mostraram que o desligamento do peptídeo da KOR ocorreu em certa extensão, mas infelizmente nas condições de análise por RP-HPLC empregadas não fomos capazes de detectar os produtos formados. Metanólises adicionais foram realizadas em presença de Ca(OAc)2 empregando peptidil-KOR relacionados ao hormônio colecistocinina: Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-KOR(1), Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-KOR (2) e Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Arg(Mtr)-KOR (3). Os rendimentos de desligamento dos peptídeos 1, 2 e 3 foram 54, 68 e 84%, respectivamente. Não foram detectadas nos meios reacionais quantidades significativas de produtos secundários resultantes de rearranjos ou de transesterificação simultânea do éster presente na cadeia lateral do resíduo de ácido aspártico. Estes resultados evidenciaram que a assistência do Ca2+ é seletiva e o método aplicável a peptídeos contendo arginina e ácido aspártico protegidos ligados à resina de Kaiser. O efeito do solvente foi investigado realizando-se metanólises de Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-KOR em DCM, DMSO e CHCl3 em presença de Ca(OAc)2. Em 72 horas as metanólises realizadas em DMSO foram quantitativas, enquanto que em DCM ou CHCl3 estas apresentaram rendimentos de ~63%. Em seguida, examinamos a capacidade do Eu3+ em assistir a reação de metanólise de peptidil-KOR em DCM. Os rendimentos de desligamento do peptídeo foram semelhantes ou ligeiramente superiores aos obtidos em presença de Ca2+. Estudos adicionais demonstraram que não é necessário excesso molar de Ca2+ ou Eu3+ para o aumento da eficiência das metanólises. Metanólise e etanólise de Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-KOR em DCM e DMSO em presença de Ca(OAc)2, EuCl3 e TbCl3 também foram realizadas. As metanólises em DCM em presença de Ca2+, Eu3+ ou Tb3+ forneceram o produto desejado com 62, 95 ou 95% de rendimento, respectivamente. Em DMSO, a reação assistida por Ca2+ foi quantitativa, mas nenhum produto foi obtido em presença de Eu3+ ou Tb3+. As etanólises em DCM assistidas por estes ións lantanídicos foram também mais eficientes do que as mediadas por Ca2+ (28, 17 e 5%, respectivamente). Em DMSO, observou-se a formação do éster etílico apenas para a reação assistida por Ca2+. O rendimento de desligamento do peptídeo da KOR foi de 80%, mas observou-se a presença de um produto secundário no peptídeo &#945;-esterificado bruto. Novamente, nenhum produto foi obtido nas reações assistidas por Eu3+ ou Tb3+ em DMSO. Estudos adicionais demonstraram que Ca(OAc)2 pode também assistir a aminólise de Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-KOR por Arg(HCl)OMe ou Arg(HCl)OEt em DMF. Os rendimentos de desligamento do peptídeo da KOR foram superiores a 70%, sendo os ésteres desejados os produtos majoritários formados nos meios reacionais (47 e 68% do total, respectivamente). Na ausência do íon metálico, os rendimentos foram de apenas 10-13%. Reações comparativas evidenciaram que a aminólise assistida por Ca2+ é equivalente (ou ligeiramente inferior em termos de seletividade) àquelas descritas na literatura catalisadas pelo ácido acético. Tentativas de aminólise em DMSO, NMP e DMSO/tolueno (1:1, v:v) na presença de Ca2+, Eu3+ e Tb3+ também foram feitas. Os resultados demonstraram que apenas o Ca2+ foi capaz de assistir a maioria delas. Isto ocorreu provavelmente devido a interações entre o DMSO e os lantanídeos. Uma análise preliminar de Ac-Ala-Gly-Lys(2-Cl-Z)-KOR e de Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-KOR através de HR-MAS na presença e ausência de Ca2+ foi feita com o intuito de investigar as interações estabelecidas entre o íon metálico e os peptídeos sob o ponto de vista estrutural. Os resultados obtidos sugeriram que a presença do Ca2+ diminue a mobilidade da cadeia peptídica, o que sugere complexação. Uma complexação tomaria a ligação peptídeo-KOR mais susceptível ao ataque nucleofílico do álcool ou aminoácido esterificado. Medidas de inchamento de peptidil-KOR em diferentes solventes puros e nas misturas utilizadas nos estudos descritos acima demonstraram que a solvatação da peptidil-KOR não é o fator determinante na eficiência destas reações. Por outro lado, estudos qualitativos sugeriram, que a solubilidade dos sais de cálcio, európio e térbio seja crucial. Concluindo, os dados obtidos até o momento indicam que a metanólise, etanólise e aminólise de peptidil-KOR assistidas pelos íons Ca2+ consistem em uma alternativa nova e atraente para preparar ésteres &#945;-metílicos e &#945;-etílicos de N&#945;-acil-peptídeos totalmente protegidos ou desprotegidos. As reações foram realizadas em pH aparente neutro e se mostraram muito seletivas à ligação oxima.The ultimate goal of the present work was to propose and stablish a new method to prepare a-esterified protected peptides. At first, we examined the effect of HAc, Ca(OAc)2 and mixtures of both on the efficiency of methanolysis of Ac-Ala-Gly-X-KOR (where, X= Gly, Ala or Phe) in DCM. Surprisingly, the reactions carried-out in the presence of Ca(OAc)2 gave the corresponding esterified peptides with the highest yields. Based on these data, we compared the efficiencies of methanolysis of Ac-Ala-Gly-X-KOR [where, X= Lys(2-Cl-Z), Phe, Ala or Gly] assisted by the calcium ion. They showed to be dependent on the nature of the C-terminal residue linked to the solid support since the yields found for 6-hour reactions were: Lys(2-Cl-Z)< Phe <Ala < Gly. After 48 h of reaction, yields were all higher than 68%. The possibility of obtaining Ac-Ala-Gly-X-OEt [where, X= Lys(2-Cl-Z) or Ala] using the same procedure was then investigated. In 72 hours at 37°C Ac-Ala-Gly-Ala-OEt and Ac-Ala-Gly-Lys(2-Cl-Z)-OEt were produced with yields of 69% and 24%, respectively. When DCM was replaced by DMSO or 25%DMSO/toluene at 55°C, the percentages of peptide release from Ala-Gly-Lys(2-Cl-Z)-KOR were 44% in 72h and 66% in 36h, respectively. Benzolysis and thiolysis of Ac-Ala-Gly-X-OEt [where, X= Lys(2-C-Z) or Ala] were tested as well. Despite the fact that amino acid analysis of the remaining peptidyl-KOR showed that the peptide detachment from the resin had occurred to some extent, we were not able to detect by analytical RP-HPLC the products formed in the reaction media. We also studied the methanolyses of some peptidyl-resins related to the peptide hormone cholecystokinin: Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-KOR (1), Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-KOR (2) and Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Arg(Mtr)-KOR (3). The yields of peptide detachment from 1, 2 or 3 were 54, 68 and 84%, respectively. No significant amounts of byproducts resulting from possible rearrangements or simultaneous transesterification of the ester present at the lateral side chain of aspartic acid were detected in the reaction media. Such results allowed us to conclude that the procedure proposed was quite selective and applicable to peptides containing protected arginine or aspartic acid attached to Kaiser oxime resin. The effect of the solvent on the methanolysis efficiency was then investigated. For that, reactions containing Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-KOR and Ca(OAc)2 suspended in DCM, DMSO and CHCl3 were carried-out. That in DMSO was quantitative while those in DCM or CHCl3 yielded the esterified peptide with 63% in 72 h. The ability of Eu3+ to assist methanolysis of peptidyl-KOR in DCM was demonstrated since peptide detachment yields for some reactions were similar or slightly superior to those assisted by Ca2+. Additional studies showed that molar excess of Ca2+ or Eu3+ is not required for the enhancement of methanolysis efficiency. Comparative methanolyses and ethanolyses of Ac-lle-Ser(Bzl)Asp(OcHex)-KOR assisted by Ca2+, Eu3+ and Tb3+ in different solvents were also studied. Methanolysis in DCM in the presence of Ca2+, Eu3+ or Tb3+ supplied the desired product with yields of 62, 95 or 95%, respectively. In DMSO, the reaction assisted by Ca2+ was quantitative, but no product was formed in presence of Eu3+ or Tb3+. Ethanolysis in DCM assisted by Eu3+ or Tb3+ was also more efficient than that performed in presence of Ca2+ (28, 17 and 5%, respectively). However, in DMSO the desired &#945;-ethyl ester was formed only in the presence of Ca2+. We were able to show that Ca(OAc)2 can also assist the aminolysis of Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-KOR in DMF by Arg(HCl)OMe or Arg(HCl)-OEt. The peptide detachment yields were higher than 70%, being the desired esters the major products formed in the reaction medium. In the absence of the metal ion, yields were only 10-13%. Further studies evidenced that aminolysis assisted by Ca2+ is equivalent (or slightly inferior in terms of selectivity) to those described in the literature that uses HAc as catalyst. Attempts of aminolysis in DMSO, NMP, DMSO/toluene (1:1, v/v) containing Ca2+, Eu3+ and Tb3+ showed that only Ca2+ was able to assist the formation of the esterified peptide in all these solvents. This is probably due to DMSO interaction with the lanthanide ions. Preliminary analyses of two peptidyl-KOR by HR-MAS in the presence and absence of Ca2+ were performed in order to obtain structural information that could help us to determine the interactions established between the metal ion and peptides. The results found indicated that the presence of Ca2+ makes peptide chain less mobile, which suggests complexation. A complexation could make the peptide-resin oxime bond more susceptible to nucleophilic attacks, favoring solvolysis and aminolysis. Swelling measurements of Ac-Ala-Gly-Lys(2-Cl-Z)-KOR and Ac-lle-Ser(Bzl)-Asp(OcHex)-KOR in pure solvents and in the mixtures employed showed that the solvation of peptidyl-KOR is not the factor that determines the efficiency of these reactions. On the other hand, qualitative studies suggested that the solubility of the calcium, europium and terbium salts could be crucial. Hence, the data presented here indicate that methanolysis, ethanolysis and aminolysis of peptidyl-KOR assisted by Ca2+ provide a new alternative and attractive way to prepare fully protected or unprotected N&#945;-acyl-peptides &#945;-methyl and &#945;-ethyl esters. The reactions were performed at neutral pH and showed to be very selective to oxime bond