Hierarchical nanopatterns for cell adhesion studies

Hierarchical nanopatterned interfaces are an intriguing tool to study clustering processes of proteins like for example integrins that mediate cell adhesion. The aim of this work is the development of innovative methods for the fabrication of hierarchical micro-nanopatterned surfaces and the use of such systems as platforms to study cell adhesion. In the first part of this work different approaches are presented which are suitable for preparing micro-nanopatterned interfaces at a large scale and high sample throughput as required for biological studies. Nanopatterning is achieved by employing diblock copolymer lithography, a method previously reported to be suitable for the fabrication of extended arrays of noble metal nanoparticles by pure selfassembly. The particles are thereby embedded in a micellar shell built up by the polymer, which can be transferred to solid interfaces. Within this work the method has been combined with conventional lithographic techniques to control the particle orientation on discrete areas on the substrate material with single particle precision. Electron beam lithography was used to immobilize gold particles by cross-linking the polymeric matrix with a focused electron beam. The benefits of high precision, single particle deposition and arbitrary pattern design of this technique are opposed by the lack of ability to cover areas larger than a square millimeter in one day exposure time. To overcome this drawback, nanopatterned silicon chips were completely coated with an electron sensitive resist that covered all particles on the substrate. After illuminating the resist by electron beam lithography in desired areas, the unexposed parts including the underlying particles could be removed. Washing off the protecting resist in exposed parts revealed the gold particles pattern. With this technique exposed areas could be increased to square centimeter areas within one day exposure time. As a further approach a new method was developed by exposing the substrate through a metal grid to electrons emitted by an electron flood gun rather than scanning the substrate by a focused beam. Micropatterned areas of several square centimeters could be prepared within minutes, even on non-conductive glass substrates. The three different approaches now provide a toolbox out of which a method can be chosen that suits the respective scientific purpose. Possibilities range from single particle deposition to larger scale arbitrary patterns, that can even be transferred to non-conductive and transparent substrates. The second part of the work, the cellular interactions of rat embryonic fibroblasts (REF) and dendritic cells (DC) with the biofunctionalized micro - nanopatterns produced were studied. Biofunctionalization included linkage of a cell receptor addressing peptide to the nano-particles and a protein repellent layer in between to avoid unspecific interaction. Fluorescent and electron microscopy images revealed, that cellular anchor points are confined to the underlying micro-nanopattern of gold particles. Intracellular actin networks connect to these protein anchor points, forming so called focal adhesions, and thereby mediate mechanical stress. At sizes of the squared adhesive patches of larger than or equal to 1 µm actin fibers connected to one adhesive patch. Whereas, if patterns consisted of squared patches smaller than or equal to 500 nm side length the actin fibers bridged these pattern gaps over several adhesion domains. Patterns with edge lengths of 100 nm comprising 6 ± 1 particles per patch were found to be the minimum number of adhesion receptors that need to cluster in order to induce adhesion. Cell-surface interactions have also been studied with dendritic cells, that play a key role in the immune system since they capture antigens in peripheral tissues and migrate to lymph nodes to present the processed antigen to T-cells and trigger an immune response. In contrast to fibroblasts, DCs were also able to adhere to gold particles that were functionalized with a control peptide that does not address integrins and to particles that were not functionalized at all. Additionally DC adhesion could be induced even on homogeneous patterns with spacings of up to 130 nm. Dendritic anchor points were confined to squared adhesive patches if the pattern comprised edge lengths of 5 µm or 10 µm, but were able to bridge pattern gaps if hierarchical structures consisted of 1 µm and 500 nm adhesive areas.Hierarchische Nanostrukturen sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung kooperativer biologischer Prozesse. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuartiger Verfahren zur Herstellung von biofunktionalisierten Mikro-/Nanostrukturierten Oberklächen und deren Anwendung als Substrat zur Untersuchung Integrin vermittelter Zelladhsion. Der erste Teil dieser Arbeit umfasst die Entwicklung innovativer Methoden zur Herstellung Mikro-/Nanostrukturierter Partikelfelder. Die weitere Verwendung dieser Substrate zur Erforschung biologisch relevanter Fragestellungen erfordert dabei den Einsatz kostengünstiger Verfahren die eine großflächige Strukturierung mit hohem Probendurchsatz ermöglichen. Mizellare Zweiblock-Coploymer Lithographie wurde zur Darstellung metallischer Nanopartikelmasken eingesetzt. Hierbei werden mit Metallsalzen beladene Polymermizellen durch reine Selbstorganisation auf Oberflächen übertragen und bilden dabei regelmäßig angeordnete Nanopartikel. Dieses Verfahren wurde im Rahmen der Arbeit mit verschiedenen konventionellen Lithographietechniken kombiniert. Durch den Einsatz von Elektronenstrahllithographie kann die den Metallkern umgebende Polymermatrix auf der Oberfläche vernetzt werden und so selbst einzelne Partikel selektiv immobilisiert werden. Dieser hohen Präzision steht jedoch die geringe Strukturierungsgeschwindigkeit von wenigen Quadratmillimetern pro Tag gegenüber. Um diesen Nachteil zu umgehen wurden Partikel bedeckte Siliziumchips mit einem elektronenempindlichen Lack beschichtet. Durch die Bestrahlung des Substrats mit einem fokussierten Elektronenstrahl wurde der Lack an den entsprechenden Stellen immobilisiert und konnte an den übrigen Flächen zusammen mit den Partikeln entfernt werden. Die Mikro-/Nanostruktur konnte durch Abwaschen des Lacks über den verbleibenden Partikeln freigelegt werden. Durch dieses Verfahren konnte die belichtete Fläche pro Tag auf einen Quadratzentimeter erhöht werden. Durch Bestrahlung des Substrats mit einer unfokussierten Elektronenquelle (flood-gun) durch ein Metallgitter konnten Mikro-/Nanostrukturen von einigen Quadratzentimetern innerhalb von Minuten auch auf nichtleitenden Glassubstraten erzeugt werden. Die drei verschiedenen Methoden stellen damit eine Reihe von Werkzeugen dar die nun, entsprechend der jeweiligen wissenschaftlichen Zielsetzung eingesetzt werden können. Die Strukturierungsmöglichkeiten reichen von einzelnen Partikeln bis hin zu großflächigen aperiodischen Mustern auch auf nichtleitenden und transparenten Substraten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die zellulären Wechselwirkungen von Rattenembryonenfibroblasten (REF) und dendritischen Zellen (DC) mit biofunktionalisierten Mikro-Nanostrukturen untersucht. Biofunktionalisierung umfasst dabei die Anbindung von spezifischen Peptiden an die Nanopartikel, sowie die Anbindung einer proteinabweisenden Schicht zwischen den Partikeln um unspezifische Interaktionen zu verhindern. Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopiebilder zeigten, dass die zellulären Ankerpunkte auf die Fläche der darunterliegenden Mikro-/Nanostruktur von Goldpartikeln begrenzt sind. Intrazelluläre Aktinnetzwerke die mechanische Belastungen in der Zelle weiterleiten binden an diese Ankerpunkte und führen zur Bildung sogenannter Fokaler Adhäsionen. Bei Kantenlängen der quadratischen adhäsiven Flächen größer oder gleich 1 µm binden Aktinfasern zu einer dieser Flächen. Sind diese Kantenlängen kleiner oder gleich 500 nm werden sie von Aktinfasern überbrückt die dann an mehrere dieser Flächen binden. Die Minimalanzahl an Integrinen die nötig sind um kooperativ Adhäsion auszulösen war bei einem Muster von 100 nm Kantenlänge, die je 6 ± 1 Partikel enthalten erreicht. Zell-Oberflächen Interaktionen wurden auch bei Dendritischen Zellen (DC) untersucht. DCs spielen eine Schlüsselrolle im Immunsystem, da sie Antigene im äußeren Gewebe abfangen, dann zu den Lymphknoten wandern um dort das Antigen T-Zellen zu präsentieren die wiederum eine Immunantwort induzieren. Im Gegensatz zu Fibroblasten waren DCs auch in der Lage an Goldpartikel zu binden die nicht funktionalisiert, oder mit einem Kontrollpeptid funktionalisiert waren, das keine Integrine adressiert. Darüberhinaus konnte Adhäsion auch auf Nanostrukturen mit einem Partikelabstand von bis zu 130 nm induziert werden. Dendritische Ankerpunkte waren auf quadratische adhäsive Flächen der darunterliegenden Mikro-Nanostruktur begrenzt, wenn die Strukturen Kantenlängen von 5 oder 10 µm umfassten. Bei Strukturen von 1 µm oder 500 nm Kantenläge wurden diese Flächen von DCs überbrückt