Entwicklung neuer Methoden zur massenspektrometrischen Charakterisierung von Biomolekülen Development of new methods for characterization of bio-molecules by means of mass spectrometry

In dieser Arbeit werden von mir neu entwickelte Strategien und Algorithmen vorgestellt, welche die Proteinidentifikation mittels MALDI-TOF-MS "peptide mass fingerprinting" unter Verwendung einer externen Kalibrierung so weit verbessern, dass auf die Anwendung einer internen Kalibrierung gänzlich verzichtet werden kann. Die Algorithmen basieren auf der Beobachtung, dass die Variation in den bestimmten Flugzeiten der sich an unterschiedlichen Positionen auf dem MALDI-Probenträger befindlichen Peptide auf zwei systematische Fehler zurückführen lässt. Zum einen wird bei Wechsel der Position der Nullpunkt des Massenspektrums verschoben, das heißt alle Massen weichen danach um einen bestimmten konstanten Betrag von den vorherigen Werten ab. Zum anderen können die Massenspektren nach Wechsel der Position noch zusätzlich linear gestreckt oder gestaucht sein. Im ersten Fall wird jede einzelne gemessene Masse mit einem bestimmten für alle Massen gleichen Fehlerbetrag behaftet. Die Differenzen zwischen den einzelnen gemessenen Massen bleiben davon jedoch unberührt. Im zweiten Fall werden sowohl die Absolutwerte, als auch die Massendifferenzen verändert. Die Algorithmen erkennen diese systematischen Fehler und ermöglichen, auch wenn die Massenrichtigkeit der generierten Daten sehr gering ist, eine korrekte Identifizierung der analysierten Proteine. Um Proteine eindeutig in großen Proteinsequenzdatenbanken zu identifizieren, wurde von mir ein Algorithmus entwickelt, der mit Hilfe der Parameter: Standardabweichung, Trefferanzahl und prozentualer Sequenzabdeckung für jedes Protein einen "Scoring"-Faktor" Z berechnet. Mit diesem neu entwickelten "Scoring"-Verfahren konnten z.B. 52 von 96 gentechnisch hergestellten Proteinen ohne Eingreifen des Menschen eindeutig identifiziert werden. In keinem Fall wurde ein falsch-positives Ergebnis geliefert. Weiterhin wurde von mir das Softwarepaket "MS-Proteomics" entwickelt, dass in kurzer Zeit vollautomatisch eine große Anzahl von massenspektrometrischen Datensätzen einliest, die Proteinidentifikation durch Abgleich mit einer in wenige Sekunden aus einer ausgewählten Proteindatenbank berechneten Peptidsequenzdatenbank durch Anwendung der oben erwähnten Algorithmen vornimmt und die Ergebnisse übersichtlich darstellt. Die Software liest darüber hinaus 2D-Gelbilder ein und weist den detektierten Proteinspots die Ergebnisse der Datenbanksuche automatisch zu. Alle relevanten Ergebnisse wurden publiziert oder eingereicht zur Veröffentlichung in den anerkannten wissenschaftlichen Fachzeitschriften "Analytical Chemistry" und "Electrophoresis" (die entsprechenden Literaturhinweise finden sich Anhang). Ein Internetversion von MSA 2.0 wird nach Veröffentlichung dieser Arbeit unter http://www.scienion.de/msa der wissenschaftlichen Gemeinde zur Verfügung gestellt.1. Einleitung, Zielsetzung 1 2. Zielsetzung der Arbeit 28 3. Material und Chemikalien 29 4. Ergebnisse und Diskussion 33 5. Zusammenfassung, Summary, Publikationen 86 6. Summary 88 7. Literaturverzeichnis 9