Retention of atmospherically deposited nitrogen in soil: field and laboratory experiments using 15N isotope and 15N CPMAS NMR spectroscopy

Since a few decades, the balance of the nitrogen (N) cycle has been deeply disturbed by human activies. The global impact of these activities on the N cycle can be described as a doubling of the transfer from the vast and unreactive atmospheric pool to biologically available forms (N fixation). The main sources responsible for the increase of reactive N emissions are the use of artificial fertilisers (NH3) as well as the combustion processes (NOx). Reactive N is then transformed, transported by both the atmosphere and the hydrosphere and, finally, deposited on both the terrestrial and the aquatic ecosystems with potentially strong impacts. Amongst the terrestrial ecosystems, the temperate forests are particularly sensitive to reactive N increases for various reasons: they are located near to strongly anthropised areas and are thus subjected to strong depositions; they are naturally N-limited and their biochemical cycle can indeed be strongly influenced by additional N, which leads to eutrophication and potential impacts such as soil acidification, nitrate leaching and losses of biodiversity within microorganisms, plants and fauna communities. Previous studies carried out in temperate forest ecosystems have shown that the soil, namely the soil organic matter, acts as a main deposited N sink for the ecosystem. However, biogeochemical reactions responsible for N retention in the soil are still not fully understood. Moreover, the majority of the concerned studies were conducted in acidic or hydromorphous soils and very little is known today about the fate of N deposition under other soil physico-chemical conditions. Consequently, the present research aims at filling some of the gaps described above and deals with two main topics concerning the retention of atmospherically deposited N in soils that are (1) the characterisation of the retention of atmospherically deposited N in the soil, in terms of both duration and quantity, more specifically, in a well drained calcareous soil and (2) the mechanisms and processes responsible for such a retention. From a practical point of view, the retention of N deposition in the soil was characterised by means of a 15N field labelling experiment simulating N atmospheric deposition and conducted at the Grandvillard research site, in the riparian zone of La Sarine River (Swiss Prealps). The stand is a beech forest mixed with planted spruces. The soil consists of a well drained calcareous fluvisol with a fast organic matter turnover. We tracked the N tracers (15NH4+ or 15NO3-, corresponding to the main forms of deposition) from short-term (hours, days or weeks) to longer-term intervals (one year), by measuring the partitioning of 15N into different biochemical soil fractions (extractable N, microbial N, roots N and N immobilised in soil). Aiming at studying the mechanisms and processes responsible for N retention, we performed two laboratory experiments. The first one was an acid hydrolysis, in order to determine the proportion of N deposition retained in the hydrolysable fraction (i.e. the more labile N forms, including the most bioavailable ones) as well as in the non-hydrolysable fraction covering the more recalcitrant N compounds. Within the framework of this experiment, we compared the results obtained in Grandvillard and in an aditional constrasting site (Alptal). The second experiment was a short-term (one hour to one week) laboratory incubation of sterilised and not sterilised soils, which purpose was to highlight the relative importance of biotic and abiotic processes in N immobilisation. Soils were labelled with either 15NH4+ or 15NO3- and subjected to 15N CPMAS NMR spectroscopy analysis, which is a powerful technique to identify the N organic molecules in soils. Within the framework of the field labelling experiment, more than half of the tracers (either 15NO3- or 15NH4+) was recovered in the soil between one hour and one year after labelling. Therefore, the general assumption that non-fertilised temperate forest soils are the main sink for deposited N can be confirmed. Since previous studies showing the importance of the soil for the retention of deposited N were all conducted on either acidic or hydromorphous soils, our results allow us to extend the validity of their general conclusions to a wider range of unfertilised temperate forest soils. We further showed that the main forms of N deposition (i.e. NO3-and NH4+) were retained in the soil within the same range of magnitude, in spite of their different biochemical pathways. N retention occurred mainly in the soil organic layers and, consequently, our results confirme the importance of the organic fraction in the deposited N retention. Since deposited N was retained in the soil in the very short term, we confirmed the presence of very fast processes and demonstrated that the very short term dynamics determined the fate of deposited N in the longer term: the main processes were i) a loss of deposited N as extractable through lixiviation (and lateral fluxes) and ii) a retention as N immobilised in soil. Furthermore, we demonstrated that N immobilisation brought deposited N both into the hydrolysable and into the recalcitrant fractions of soil N within short-time range (i.e. one week) . We also demonstrated that the hydrolysability (hydrolysable N/ total N) was constant over the year. Within the framework of the laboratory incubation of soils subjected to the 15N CPMAS NMR spectroscopy analysis, we showed that all NMR spectra were dominated by a single signal corresponding to the amide-peptide structure, whatever the soil layer concerned (organic or organo-mineral), the form added (NO3- or NH4+) and whether the soil was sterilised or not. Such dominance of proteinaceous compounds was in agreement with the results obtained in humic substances and in various soils all over the world. Further to the extractable 15N dynamics during the incubation, we proposed that biotic processes were dominant in the short-term N immobilisation. However, an abiotic fixation of less importance was not excluded for 15NO3-. Considering our results, we propose two mechanisms responsible for the retention of deposited N in soil in the long term. The first mechanism is a rapid and stable immobilisation in the recalcitrant pool of soil organic matter. Our results showed that biotic and abiotic processes could be involved: the afore-mentioned process of abiotic nitrate fixation could lead to the N immobilisation in heterocycles whereas N incorporated in amides and then stabilised in soil organic matter seemed to be the major pathway. The second mechanism of retention we are proposing is the biological recycling within the soil or the soil-plant system: on a short scale, microbial recycling seemed to be very rapid because deposited N was mainly present under a biosynthesised form (amides), in spite of the low amounts of tracer found in the microbes. Within the soil profile, roots recycling was probably efficient: fine roots, which are often the major contributors of soil organic matter were an important sink for N deposition all over the year. The combination of various scales and techniques allowed the connection between the dynamics of N retention in soil organic layers observed and the mechanisms responsible for it (i.e. rapid immobilisation in a recalcitrant pool and biological recycling through micro-organisms and plants). The results of this multi-scale approach suggest further developments and impacts for the modelling of the long-term fate of deposited N.Depuis de nombreuses décennies, l'équilibre du cycle de l'azote (N) a été fortement perturbé par les activités anthropiques, dont l'impact se traduit par un doublement des transferts chimiques de l'azote atmosphérique non réactif en formes assimilables par les organismes vivants (processus connu sous le terme de fixation de l'azote). L'augmentation des émissions d'azote sous forme réactive est principalement due à l'utilisation de fertilisants synthétiques (NH3) ainsi qu'à la combustion de carburants fossiles (NOx). L'azote émis est transformé, puis transporté par l'atmosphère et l'hydrosphère pour se déposer dans les écosystèmes aquatiques et terrestres. Cette augmentation des dépôts atmosphériques azotés a une incidence importante sur les forêts tempérées, qui sont généralement très exposées car elles sont souvent proches des sources azotées d'origine anthropique. De plus, l'azote, en conditions naturelles, est un facteur limitant pour la productivité de ces forêts. Un apport additionnel de celui-ci peut se traduire par un dérèglement de leur cycle biogéochimique conduisant à l'eutrophisation et à d'autres impacts: acidification du sol, lixiviation de nitrate et diminution de la biodiversité au sein des communautés végétales, animales et de microorganismes, notamment. Lors d'études précédentes dans les écosystèmes forestiers tempérés, il a été démontré que le sol, en particulier sa fraction organique, agit comme un puits majeur face à ces dépôts. Les réactions biogéochimiques à l'origine de la rétention de ces dépôts ne sont pas encore totalement connues et la plupart des recherches menées sur des sols acides ou à caractère hydromorphe ne fournissent que peu d'informations sur leur devenir dans des sols soumis à d'autres conditions physico-chimiques. Notre étude a pour objectif de combler ces lacunes et traite deux points essentiels: (1) la caractérisation quantitative et temporelle de la rétention de ces dépôts dans le sol qui se focalise sur les sols carbonatés et bien drainés; (2) l'étude des mécanismes et processus à l'origine de cette rétention. Dans la pratique, une étude sur la rétention des dépôts atmosphériques azotés a été effectuée grâce à un marquage avec l'isotope 15N. Une expérience, réalisée in situ et simulant ces dépositions, a été menée à Grandvillard, site alluvial d'importance nationale au bord de la Sarine (Préalpes suisses) caractérisé par une forêt composée de hêtres et d'épicéas plantés, un sol de type fluviosol carbonaté bien drainé avec turnover rapide de la matière organique. Nous avons analysé le devenir de deux traceurs: l'ammonium (15NH4+) et le nitrate (15NO3-) qui sont les deux formes principales des dépôts atmosphériques azotés, puis effectué un suivi temporel à court terme (heure, jour et semaine) et à plus long terme (mois, année) en mesurant le 15N dans différentes fractions du sol (N extractible, N microbien, N racinaire et N immobilisé dans le sol). Les mécanismes et les processus à l'origine de la rétention d'azote dans le sol ont été étudiés par le biais de deux expériences complémentaires réalisées en laboratoire. La première, une hydrolyse acide pour quantifier les dépôts azotés retenus sous forme hydrolysable (forme la plus labile et la plus biodisponible de l'azote) et ceux retenus sous forme non hydrolysable (composés azotés les plus récalcitrants). Dans le cadre de cette expérimentation, nous avons également comparé les résultats obtenus à Grandvillard avec ceux d'un autre site aux conditions stationnelles très différentes (Aptal). La seconde expérience a consisté en une incubation à court terme (1 heure à 1 semaine), en laboratoire, de sols stérilisés ou non stérilisés, le but étant de déterminer l'importance relative des processus biotiques et abiotiques à l'origine de l'immobilisation de l'azote dans le sol. Les sols ont été marqués à 15NH4+ et 15NO3- puis analysés par 15N CPMAS NMR, technique reconnue pour l'identification des molécules organiques azotées du sol. Les résultats de l'expérience de marquage menée in situ ont permis de démontrer que plus de la moitié du traceur (15NO3- ou 15NH4+) était retenu dans le sol déjà après une heure et que les quantités étaient similaires une année plus tard, d'une part et, d'autre part, de confirmer que dans le cas des écosystèmes forestiers tempérés, le sol agit comme puits essentiel face aux dépôts atmosphériques. Grâce à cette étude, nous pouvons étendre la validité des résultats précédemment acquis pour des sols acides et à caractère hydromorphe à une plus large gamme de sols forestiers des régions tempérées. Nous avons également démontré que les deux formes principales de dépôts azotés (NO3- et NH4+) sont retenues dans le sol dans un ordre de grandeur similaire malgré leur comportement biochimique différent. La rétention d'azote a eu lieu préférentiellement dans les horizons organiques du sol confirmant ainsi le rôle capital de la fraction organique dans la rétention des dépôts azotés. Ces derniers ayant été retenues dans le sol à très court terme, nous confirmons la présence de processus très rapides déterminant le devenir de ces dépôts à plus long terme. Les principaux processus identifiés sont : 1) la perte des dépôts azotés extractibles via la lixiviation (et les écoulements latéraux); 2) la rétention d'azote dans le sol sous forme immobilisée. Nous avons également démontré que l'immobilisation de l'azote se traduit, dans un laps de temps très court (une semaine), par le transfert des dépôts azotés sous forme hydrolysable et récalcitrante. L'hydrolysabilité (N hydrolysable/N total) de l'azote natif et de l'azote marqué est constante tout à long de l'année. Dans le cadre de l'expérience d'incubation mentionnée plus haut, la NMR a montré que la présence d'un signal unique attribué à une structure de type amide-peptide était caractéristique, quel que soit l'horizon (organique ou organo-minéral), la nature du traceur ajouté (15NO3- ou 15NH4+) et que le sol soit stérilisé ou non. La dominance de ces composés protéinés est en parfaite adéquation avec les résultats obtenus par d'autres chercheurs, soit dans l'étude des substances humiques, soit dans différents sols du monde. Considérant la dynamique du 15N extractible au cours de l'incubation, nous pensons que l'immobilisation de l'azote est basée principalement sur un processus biologique quoiqu'une fixation abiotique ne puisse être totalement exclue dans le cas du 15NO3-, mais dans une moindre mesure. En conséquence, deux mécanismes à l'origine de la rétention à long terme des dépôts atmosphériques azotés dans le sol sont proposés: le premier, une immobilisation rapide et stable de l'azote sous une forme organique récalcitrante. Par ailleurs, des processus biotiques et abiotiques pourraient être impliqués: la fixation abiotique de NO3- pourrait conduire à cette immobilisation de l'azote sous forme d'hétérocycle mais l'azote incorporé sous forme d'amides, puis stabilisé au sein de la matière organique, semble être le principal processus responsable de cette immobilisation. Le second mécanisme de rétention est le recyclage biologique, dans le sol proprement dit ou par le système sol-plante; à court terme, le recyclage microbien semble être très rapide puisque les dépôts azotés ont principalement été identifiés sous une forme biosynthétisée (amide) et ceci malgré un faible taux de 15N dans le compartiment microbien. Dans le sol proprement dit, le recyclage par les racines semble être efficace car les racines fines qui jouent un rôle majeur dans les apports organiques dans le sol, constituent un important puits face aux dépôts azotés. Grâce à l'utilisation de techniques variées, la combinaison de différentes échelles nous a permis de faire le lien entre la dynamique de rétention de l'azote dans le sol et les mécanismes à l'origine de cette rétention (une immobilisation rapide dans une fraction récalcitrante ou un recyclage par le système sol-plante et les microorganismes du sol). Les résultats de cette approche multiscalaire offrent des perspectives de développement pour la modélisation du devenir des dépôts atmosphériques azotés à long terme