Progress in isolation and purification of an inhibitor of sodium transport obtained from dog urine

Progress in isolation and purification of an inhibitor of sodium transport. Among the potential modulators of transtubular sodium transport is the putative natriuretic hormone. Widespread efforts are underway to isolate this substance in pure form. The present studies describe a series of experiments directed to this goal. Urine samples in the amount of 150 liters were taken from normal, mineralocorticoid hormone “escape” dogs and were chromatographed through Sephadex G-25. The active fraction of the eluate (that is, the fraction containing the inhibitor of sodium transport) was then subjected to high pressure liquid chromatography (HPLC) in four consecutive steps using three different resins. Approximately 5% of each column eluate was diverted by use of a stream-splitting apparatus, and the fluorescent pattern was measured and recorded, in most instances following the addition of fluorescamine. Based on the respective fluorescent patterns obtained from the eluates of the successive chromatographic steps, the residual portion (95%) of each eluate was divided into fractions, and each fraction was bioassayed. In each instance only the biologically active fraction was subjected to further purification. In the first step involving HPLC and a cation exchange resin, six fractions were obtained. Only one was active. When this fraction was subjected to reverse-phase chromatography, seven new fractions emerged. Again only one was active. When it was chromatographed using a second cation exchange resin, two fluorometrically detectable peaks, termed N and H, were identifiable. N exhibited spontaneous fluorescence; H exhibited fluorescamine-dependent fluorescence. In the final step, N and H were separated and bioassayed individually. N was inactive; H proved to be a potent inhibitor of sodium transport. Accumulation of H in sufficient quantity will determine whether it is a single compound and will permit analysis of its chemical nature.Progrès dans l'isolement et la purification d'un inhibiteur du transport de sodium. Parmi les modulateurs potentiels du transport transtubulaire de sodium est l'hormone natriurétique présumée. Des tentatives sont en cours pour isoler cette substance dans sa forme pure. Ce travail décrit une série d'expériences ayant ce but. Exemples d'urine dans au total d' 150 litres aient pris provenant de chiens normaux en situation d'échappement à l'action de l'hormone minéralocorticoïde et ont été chromatographiés sur Séphadex G25. La fraction active de l'éluat (c'est-à-dire la fraction contenant l'inhibiteur du transport de sodium) a été soumise à une chromatographie liquide à haute pression (HPLC) dans 4 étapes consécutives utilisant trois résines différentes. Approximativement 5% de l'éluat de chaque colonne a été séparé par l'utilisation d'un système de fractionnement du courant et le profil de fluorescence a été mesuré et enregistré, dans la plupart des cas après l'addition de fluorescamine. La portion résiduelle (95%) de chaque éluat a été divisée en fractions et chaque fraction a été soumise à un essai biologique en fonction des spectres de fluorescence obtenus respectivement au cours des étapes chromatographiques. Seule la fraction biologiquement active a été soumise à une purification ultérieure. Dans la première étape impliquant HPLC et une résine d'échange cationique 6 fractions ont été obtenues. Une seulement était active. Quand cette fraction a été soumise à une chromatographie inverse, 7 nouvelles fractions ont été recueillies. Là encore une seule était active. Quand celle-ci a été soumise à une chromatographie au moyen d'une deuxième résine d'échange cationique, 2 pics détectables en fluorimétrie, désignés par N et H ont été identifiés. N avait une fluorescence spontanée, H une fluorescence dépendante de la fluorescamine. Dans l'étape finale N et H ont été séparés et soumis individuellement à un essai biologique. N était inactif, H s'est révélé un inhibiteur puissant du transport de sodium. L'accumulation de H en quantité suffisante permettra ultérieurement de déterminer s'il s'agit d'un composé unique et permettra d'analyser sa nature chimique