Caracterização química e aplicação bionanotecnológica dos polissacarídeos do bagaço da mandioca (Manihot esculenta Crantz)

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2018.A cada tonelada de raízes processadas de mandioca (Manihot esculenta Crantz) à produção de fécula, aproximadamente igual massa (em base úmida) de resíduos sólidos, o bagaço de mandioca (BM), é gerada. Esse subproduto é um problema às fecularias pela falta de valor comercial e, além disso, se descartado de forma inadequada, pode gerar impactos ambientais. Nesse contexto, este trabalho objetivou caracterizar quimicamente as frações pécticas e hemicelulósicas do BM e, num segundo momento, desenvolver nanopartículas mucoadesivas revestidas com pectina (PC) extraídas do BM, contendo ß-caroteno (BC) para a administração gastrointestinal, visando potencializar a biodisponibilidade desse nutracêutico lipofílico. O processo de extração das amostras de BM oriundas das safras de 2014/2015 e 2015/2016 apresentou rendimentos das frações péctica (2,42 e 3,14%, respectivamente) e hemicelulósica (2,04 e 3,34%, respectivamente - hemicelulose A - KOH 1 M) semelhantes, sendo tais frações majoritárias nas safras analisadas. Análises cromatográfica (GC) e espectroscópicas (FTIR e 1H e 13C-RMN) revelaram que o domínio RG-I da pectina consiste em uma cadeia principal de repetições de dissacarídeos a-(1?2)-L-ramnose-a-(1?4)-ácido D-galacturônico (AGal) apresentando também cadeias laterais de D-manose e D-galactose. Nas frações hemicelulose A e B (KOH 1 M) foram detectados o ácido D-galacturônico e D-manose como os constituintes majoritários de suas estruturas químicas, enquanto nas frações hemicelulósicas A e B (KOH 4 M), para além desses constituintes, as análises também reveleram altas concentrações de D-galactose. Adicionalmente, as frações de pectina e hemicelulose das safras em estudo (2014/2015 e 2015/2016) e apresentaram perfis monossacarídicos qualitativamente semelhantes, porém distintos quantitativamente. Assim, não foi possível confirmar um padrão de estrutura química para as frações desses biopolímeros. Na segunda etapa do trabalho, nanoemulsões foram preparadas pelo método de emulsificação espontânea, utilizando diferentes tipos e concentrações de óleo (triglicerídeo de cadeia média (TCM) e óleo de milho) e surfactante (Tween 20 e 80), visando otimizar as condições de preparo. A partir da escolha das melhores condições de preparo e da melhor concentração de PC testada foram desenvolvidas duas nanoformulações distintas. Assim, as nanopartículas (NP) desenvolvidas foram caracterizadas quanto ao seu tamanho, potencial zeta, índice de polidispersão (IPD), pH, morfologia e estabilidade física. O teor total e a eficiência de encapsulação (EE) do BC foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência e a atividade antioxidante in vitro pelo método DPPH (2,2-difenil-2- picrilhidrazil). O ensaio de mucoadesão foi realizado utilizando mucina da glândula submaxilar bovina e a citotoxicidade determinada em células Caco-2 pelo método da sulforrodamina B. As NP de PC contendo BC caracterizaram-se pelo formato esférico e distribuição monodispersa de partículas, com tamanhos médios de 21,3 nm (IPD 0,29) para BC PC T80-NP (nanopartícula com Tween 80) e 261,4 nm (IPD 0,1) para BC PC T20-NP (nanopartícula com Tween 20). O BC foi nanoencapsulado com sucesso, detectando-se teores de 530 e 324 µg/ml para BC PC T80-NP e BC PC T20-NP, respectivamente, com EE elevada (> 95%) e, aumento da sua capacidade antioxidante in vitro com EC50 de 0,080 e 0,074 mg/ml, respectivamente. BC PC T80-NP não evidenciou toxicidez em células Caco-2 e BC PC T20-NP apresentou apenas nas concentrações mais elevadas. Uma forte interação entre a mucina e as NP revestidas com PC foi detectada em BC PC T20-NP, a qual se mostrou estável durante 90 dias de armazenamento a -4 ºC. Os resultados sugerem que BC PC T20-NP é um produto interessante ao incremento da biodisponibilidade e permeação de nutracêuticos lipofílicos para administração em superfícies mucosas.Abstract : Every ton of cassava processed root (Manihot esculenta Crantz) from starch production generate the same amount of mass of solid waste (wet weight), called cassava bagasse (CB). This byproduct generation is a problem for starch processing industry due to lack of economic value. Besides inappropriate waste disposal promotes negative environmental impacts. This study aimed to characterize pectin and hemicellulose fractions chemical structures from CB. In addition, mucoadhesive nanoparticles coated with cassava pectin (PC) containing ß-carotene (BC) for gastrointestinal administration were developed for increasing bioavailability of this lipophilic nutraceutical. Samples from 2014/2015 and 2015/2016 seasons showed similar extraction yield for pectin (2,42 and 3,14%, respectively) and hemicellulose (2,04 and 3,34%, respectively - hemiellulose A - KOH 1 M) fractions. In this sense, both fractions were the main compounds found in the studied harvests. Chromatographic (GC) and spectroscopic (FTIR e 1H e 13C-RMN) analysis demonstrated that pectin RG-I domain comprises a main chain formed by disaccharides repetition a -(1?2)-L-rhamnose-a-(1?4)-D-galacturonic acid (GalA) with D-manose and D-galactose side chains. Hemicellulose fractions A and B (KOH 1 M) are constituted by D-galacturonic acid and D-manose, these monosaccharides are the main molecules compounds. In addition to monosaccharides above, hemicellulose fractions A and B (KOH 4 M) also present high concentration of D-galactose in their structure. The monosaccharides profile of pectin and hemicellulose fractions from 2014/2015 and 2015/2016 seasons were similar qualitatively but distinct in their contents. Therefore, none chemical structure pattern was confirmed for these biopolymers. In a second moment, nanoemulsions were prepared by spontaneous emulsification method using different types and concentration of medium chain triglyceride (MCT) and corn oil and surfactants (Tween 20 and 80), aimed to optimizer preparation conditions. The best preparation conditions and PC concentration were chosen and two nanoformulations were generated. Nanoparticles (NP) were characterized according to the size, zeta potencial, polydispersity index (PDI), pH, morphology and physical stability. The total content and encapsulation efficiency (EE) of BC were determined by high-performance liquid chromatography and in vitro antioxidant activity by the 2, 2- diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) method. The mucoadhesion assay was performed using bovine submaxillary gland mucin and the cytotoxicity determined on Caco-2 cells by the sulforhodamine B method. The pectin-coated nanoparticles containing BC showed spherical shape and monodisperse distribution, with a mean size of 21.3 nm (PDI 0.29) for BC PC T80-NP (NP with Tween 80) and 261.4 nm (PDI 0.1) for BC PC T20-NP (NP with Tween 20). BC was successfully encapsulated at amounts of 530 and 324 µg/ml for BC PC T80-NP and BC PC T20-NP, respectively, with high EE (> 95%), increasing its antioxidant capacity in vitro. BC PC T80-NP didn t exhibit cytotoxicity in Caco-2 and BC PC T20-NP was toxic for cells only in increased concentrations. A strong interaction with mucin and PC coated NP was observed in BC PC T20-NP. This NP was stable over a 90 days storage period (-4 °C). The results suggest that pectin-coated BC PC T20-NP is an interesting strategy to improve the bioavailability and permeation of lipophilic nutraceuticals for administration through mucosal surfaces