Molecular approaches for mycotoxin risk reduction

Mycotoxin contamination in food is a serious concern for human and animal health. Today, we do not know how to detoxify food materials that are contaminated with mycotoxins in ways that retain their edibility. Therefore, avoiding mycotoxins from entering the food chain is an important approach. This needs early and easy identification, detection, and quantification of mycotoxinproducing fungi. The conventional methods for the identification, taxonomy, detection, and quantification of toxigenic fungi are challenging because they require a high level of expertise and a set of sophisticated equipment. The aim of current study was to use molecular-based approaches (as they are practical, rapid, and more reliable) to identify, classify, detect, and quantify mycotoxin-producing fungi including aflatoxin-producing Aspergillus and fumonisin- and trichothecene (TC)-producing Fusarium species. The results obtained from this study suggested that there are 2 main populations of F. graminearum in Europe. The population of the 3-acetyl-deoxynivalenol (3ADON) chemotype is dominant in northern Europe and it has probably recently been spreading from Finland to north-western Russia, while the population of the 15ADON chemotype is dominant in the central and southern Europe and it has been spreading to the Denmark and Norway. The results also suggested that the homogenization of the oat flour by milling with a 1 mm sieve is important for the reproducibility of deoxynivalenol (DON) and F. graminearum DNA levels, which is evident from a higher correlation between the DON and F. graminearum DNA levels in oat grain samples that were sieved after milling. In the thesis, the F. langsethiae isolate obtained from Iranian wheat was reidentified as F. sibiricum, and the identification was confirmed by IGS sequencing. This work reports the first record of F. sibiricum from Iran, outside northern Asia and Norway, and the first isolation of F. langsethiae (a European pathogen) from western Siberia. Large variations in the DON content and the amounts of F. graminearum DNA, and poor coefficient of determination (R2 ) between these were detected in oat grain when the RIDA®QUICK SCAN kit was used for DON content estimation. This study confirmed that the coefficient of determination was usually less when DNA or DON levels were estimated from oat flour that was not ground with 0.8 mm or 1 mm sieves. DON levels obtained with the Rida®Quick method were usually higher than those obtained with accredited GC-MS method in the Finnish oat, barley, and wheat samples. The homogenization of the oat flour by sieving is therefore likely to be connected to the variations in the DON detection. Also, it was suggested that the amounts of DON close to the legislative limits should be reconfirmed with accredited quantitative analyses. In addition, isolation, identification, detection, and quantification of Fusarium and Aspergillus isolates from Egypt and the Philippines maize, wheat, and soil samples were implemented in this thesis. A. parasiticus isolates, which produced higher amounts of aflatoxins, were only found in the Philippines.Elintarvikkeiden sisältämät mykotoksiinit ovat vakava huolenaihe ihmisten ja eläinten terveydelle. Nykyään emme tiedä, miten mykotoksiineja sisältäviä elintarvikkeita voi puhdistaa niin, että niiden käyttökelpoisuus säilyy. Siksi on tärkeää välttää mykotoksiinien pääsyä elintarvike-ketjuun. Tämä vaatii mykotoksiineja tuottavien sienten varhaista tunnistamista, detektointia ja kvantifiointia helposti käyttöönotettavilla menetelmillä. Perinteiset menetelmät tunnistusta, taksonomiaa, detektointia ja toksigeenisten sienten kvantifiointia varten ovat hyvin haastavia, koska ne vaativat huippuluokan osaamista ja laitteita. Työn tarkoituksena oli käyttää molekyylibiologisia menetelmiä, koska ne ovat käytännöllisiä, nopeita ja luotettavia tunnistamaan, luokittelemaan, havaitsemaan ja kvantifioimaan mykotoksiinia tuottavia sieniä, mukaan lukien aflatoksiinia tuottavia Aspergillus-homeita sekä fumonisiinia ja trikotekeeneitä tuottavia Fusarium-punahomeita. Väitöskirjatyön tulosten perusteella esitetään, että Euroopassa on kaksi F. graminearum-populaatiota. 3ADON-kemotyyppi on vallalla Pohjois-Euroopassa ja se on ilmeisesti levinnyt hiljattain Suomesta Luoteis-Venäjälle, kun taas 15ADON-kemotyyppi on vallalla Keski- ja EteläEuroopassa, ja se on hiljattain levinnyt Tanskaan ja Norjaan. Lisäksi esitetään, että kauranäytteiden homogenointi jauhamalla 1 mm:n seulalla näyttää olevan tärkeä DON- ja F. graminearum-DNApitoisuusmittausten toistettavuudelle, mikä on osoitettu kauran korkeammalla korrelaatiolla DON ja F. graminearum-DNA-pitoisuuksien välillä. F. langsethiae -kanta, joka eristettiin Iranissa vehnästä, tunnistettiin myöhemmin F. sibiricumiksi ja tunnistus varmistettiin IGS-sekvensoinnilla. Työssä raportoidaan tästä ensimmäisestä iranilaisesta F. sibiricum-kannasta, joka oli alun perin määritetty F. langsethiae-lajiin, sekä ensimmäisestä Euroopan ulkopuolelta löydetystä F. langsethiae-kannasta, joka löytyi Länsi-Siperiasta. Aikaisemmin on usein havaittu, että kauranjyvän F. graminearum-DNA- ja DONpitoisuuksien välillä on melko huono korrelaatio. Nyt saadut tulokset vahvistivat, että korrelaatio F. graminearum-DNA ja DON-pitoisuuden välillä oli pienempi, kun ne uutettiin kauroista, jota ei oltu jauhettu käyttäen 0,8 mm: n tai 1 mm:n seuloja. Rida®Quick-pikamääritysmenetelmällä mitatut DON-pitoisuudet, olivat tavallisesti korkeammat kuin akreditoitujen GC-MS-menetelmällä mitatut DONpitoisuudet suomalaisessa kaura-, ohra- ja vehnänäytteessä. Kaurajauhojen homogenointi seulan avulla on siten todennäköisesti yhteydessä Fusarium-DNA ja DON-määrien vaihteluihin. Pikamääritysmenetelmillä havaitut lähellä suurinta sallittua määrää olevat DON-pitoisuudet olisikin vahvistettava akreditoiduilla kvantitatiivisilla kromatografisilla analyyseillä. Ensimmäisessä julkaisussa Egyptistä ja Filippiineiltä peräisin olevista maissi-, vehnä- ja maaperänäytteistä eristettiin Fusarium–isolaatteja. Lisäksi Fusariumpunahomeita tunnistettiin ja fumonisiinia tuottavien Fusarium-punahomeiden DNA:n määrää mitattiin Egyptistä ja Filippiineiltä peräisin olevista maissi- ja vehnänäytteistä. A. parasiticus-isolaatteja, jotka tuottivat suurimmat mitatut aflatoksiinimäärät, löydettiin vain Filippiineiltä