Untersuchungen an Protein-Kofaktor-Komplexen: ein kombinierter experimenteller und theoretischer Ansatz

The majority of enzymes contains one or more organic or inorganic cofactor molecule(s) attached to the protein matrix which enable their respective functions. The interaction between these cofactor molecules and the protein environment is highly specific and determines the structure–function relationship of many enzymes. The work in this thesis utilizes a combination of experimental and theoretical spectroscopic approaches in order to assess their potential and limitations for studying protein–cofactor interactions. As model systems, representatives of three different classes of complexes are investigated, namely heme proteins serving as electron shuttles, tetrapyrrole proteins acting as light sensors, and flavoproteins serving as biocatalysts. Cytochrome c (cytc) is a heme protein that primarily transports electrons within the respiratory chain and as such interacts with membrane-bound proteins. In order to contribute to a more detailed understanding of the conformational dynamics of cytc, both the acid-induced unfolding process at low pH and the alkaline transition at high pH values are investigated. Resonance Raman (RR) spectroscopy, which is highly sensitive to structural changes at the heme site, was used to study three selected variants of cytc at low pH. Two conserved amino acids, namely Met80 and Tyr67 which are found in the vicinity of the heme cofactor, were mutated to form one single and two double mutants. These variants were analyzed in order to elucidate the role of these two key residues for the acid-induced unfolding pathway as well as for the conformational stability of cytc. Spectroscopic data demonstrate a complex interplay between these residues: The three-dimensional structure of the pocket is affected by the substitution, as concluded from significantly different peroxidation rates, presumably due to a change in accessibility of the cofactor pocket to small molecules. However, the acid-induced unfolding pathway was found to be almost the same for all cytc variants, indicating that the conserved residues Met80 and Tyr67 play only a minor role in this process. In solution at alkaline pH, cytc is known to readily form a heme species with His and Lys as axial ligands, which is detectable by RR spectroscopy and through changes of the midpoint potential of the heme redox transitions. Nevertheless, in experiments using surface-enhanced resonance Raman spectroscopy (SERRS) on cytc immobilized onto a Ag electrode coated with negatively charged self-assembled monolayers (SAM), which simulate the membrane environment, these alkaline species could neither be detected spectroscopically nor was a shift of the redox transition observed in cyclovoltammetric measurements. Since in the native system cytc is constantly associated to the membrane, an involvement of this alkaline species was concluded to be very unlikely in vivo, in line with previous spectroscopic results. In a second case study, the reaction mechanism of the NDHII flavoprotein that utilizes a FAD cofactor to transfer electrons from NADH to quinones is investigated. Since it is a membrane-associated protein, NDHII was immobilized onto a SAM-coated Au electrode. The sequence of substrate interactions with the protein is controversially discussed in literature and conflicting results have been published. The NADH molecule and the quinone molecule bind to NDHII either simultaneously or consecutively in order to enable mediated electron transfer. Implementing a combination of surfaceenhanced infrared absorption (SEIRA) difference spectroscopy and electrochemistry, the individual steps of NADH binding, quinone binding and the change in oxidation state of the quinone could be monitored. It was found that both substrate molecules are required to bind to NDHII, forming a ternary complex, in order to enable intersubstrate electron transfer (ET). Moreover, quantum chemical calculations of quinone IR spectra could show that the electron-accepting quinone also takes up one proton after ET. Cyclovoltammetric and spectroscopic data for two different quinones (DUQ and DDB) shows that an aliphatic tail found in some quinones determines the type of molecular interaction with NDHII. Generally, the combination of multiple experimental and theoretical techniques could provide new insights and helped creating a consistent picture of the reaction mechanism and the substrate-dependent dynamics. Thus, existing and sometimes contradicting data could be partially reconciled. The last model system addresses the light sensor bacteriophytochrome which harbors a linear tetrapyrrole cofactor that experiences an E/Z isomerization reaction in order to trigger intramolecular protein conformational changes, which eventually cause a signal relay via a histidine phosphorylation reaction. Due to the large flexibility of the tetrapyrrole, the varying protein–cofactor interactions play a role not only for the different steps of the photoreaction but also regarding the stabilization of the resting state. The determination of the correct geometry of the cofactor within the protein environment therefore represents a challenge. Here, the biliverdin (BV) cofactor structure in the Pfr ground state of bacteriophytochrome Pap1 was characterized and a computational quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) hybrid approach was employed in order to calculate vibrational spectra for this cofactor. Furthermore, this approach was expanded by combining these calculations with molecular dynamics (MD) simulations to account for the conformational fluctuation of the protein and the BV moiety. The resulting sum of calculated spectra of BV reproduced the corresponding experimental Raman spectra much better than spectra calculated from individual MD frames, both in terms of band positions and band widths. For Pap1, the exact nature of the cofactor-attachment to the protein and the specific configuration of the four pyrrole rings could not be determined from the available crystallographic data. Therefore, these properties were investigated by calculating vibrational spectra for specifically modified BV cofactors. In this way, it could be shown that only a BV-like attachment at ring A and an E configuration at ring D yield calculated spectral data that are compatible with the experimental Raman spectra, indicating a ZZEssa configuration for the Pfr resting state of Pap1. For the unmodified BV cofactor, correlation analysis of the obtained set of spectroscopical and geometrical data yielded multiple relationships between spectroscopical and structural parameters for the tetrapyrrole cofactor. In addition to providing new insights, these findings also reproduce correlation results published before and in this way serve as validation for the expansion of the methodological approach and the combination of theoretical and experimental results as presented in this work.Die Mehrheit der Enzyme beinhaltet mindestens einen proteingebundenen organischen oder anorganischen Kofaktor, der diesen ihre jeweilige Funktion ermöglicht. Die molekularen Wechselwirkungen zwischen dem Protein und dem Kofaktor sind dabei hochspezifisch und bestimmen für viele Proteine den Zusammenhang von Struktur und Funktion. In dieser Arbeit wird als Ansatz eine Kombination aus experimentellen und theoretischen schwingungsspektroskopischen Methoden zur Analyse von Protein-Kofaktor-Wechselwirkungen verwendet und hinsichtlich des Potenzials und der Einschränkungen diskutiert. Als repräsentative Modellsysteme wurden der Elektronentransporter Cytochrom c (cytc), das als Lichtsensor fungierende Bakteriophytochrom Pap1, sowie eine NADH oxidierende und Chinon reduzierende Dehydrogenase NDHII untersucht. Mittels Elektrochemie und Resonanz-Raman-Spektroskopie (RR-Spektroskopie) wurden die strukturellen und elektronischen Veränderungen des Häm-Kofaktors in cytc bei unterschiedlichen pH Werten der Umgebung untersucht. Für drei cytc-Varianten, in denen die konservierten Aminosäurereste Met80 und/oder Tyr67 durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, wurde gezeigt, dass die pH-abhängige Veränderung der Wechselwirkungen zwischen Häm und Proteinumgebung sehr ähnlich ist, obwohl für diese Varianten unterschiedliche Peroxidationsraten und damit strukturelle Unterschiede bekannt sind. Dies bedeutet, dass trotz der Mutationen, die zu strukturellen Veränderungen in der Proteintasche führen, der säureinduzierte Entfaltungsprozess des Proteins für alle Varianten vergleichbar abläuft und die Aminosäuren Met80 und Tyr67 dabei eine untergeordnete Rolle spielen. Die Untersuchung von nativem cytc bei alkalischen pH-Werten erfolgte im oberflächenimmobilisierten Zustand auf einer SAM-beschichteten Silberelektrode und folgte der Frage, ob die alkalische Spezies, die sich bei diesen pH-Bedingungen in Lösung bildet, auch für cytc an einer Oberfläche entsteht und damit eine funktionelle Rolle beim Elektronentransport, für den cytc sich entlang einer Membranoberfläche bewegt, besitzen könnte. Unter Verwendung von oberflächenverstärkter Resonanz-Raman-Spektroskopie (SERRS) und zyklischer Voltammetrie konnte die Existenz der alkalinen Spezies, deren Protein–Häm-Wechselwirkungen sich durch eine axiale His/Lys-Ligandierung am Häm-Eisen stark von der axialen His/Met-Ligandierung im nativen cytc unterscheiden, auch bei alkalischen pH-Werten ausgeschlossen werden und so Ergebnisse voriger rein elektrochemischer Studien entkräften, was den Vorteil der Kombination mehrerer Methoden zur Untersuchung der Protein-Kofaktor-Interaktionen demonstriert. Als zweites Modellsystem wird der Reaktionsmechanismus des Flavoproteins NDHII untersucht. Dieses Enzym überträgt Elektronen mittels eines FAD Kofaktors von NADH zu einem Chinon. Da NDHII ein membranassoziiertes Protein ist, wurde es auf einer SAM-beschichteten Au Elektrodenoberfläche immobilisiert. Die Reihenfolge der Substratinteraktion mit dem Protein ist in der Literatur kontrovers diskutiert, das NADH- und das Chinonmolekül können entweder gleichzeitig oder nacheinander am NDHII binden. Eine Kombination aus oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptions-Differenz-Spektroskopie und Elektrochemie konnte in dieser Arbeit die Bindung des NADH und des Chinons an das Protein und auch die Veränderung des Oxidationszustandes des Chinons in einzelnen Schritten darstellen. So wurde gezeigt, dass sowohl NADH, als auch das Chinon an das Protein gebunden sein müssen, um einen Elektronentransfer zu ermöglichen. Quantenmechanische Berechnungen der Infrarotspektren des Chinonsubstrats ergaben ergänzend, dass das durch NDHII reduzierte Chinon dabei ein Proton aufnimmt. Zyklovoltammetrische Messungen mit zwei verschiedenen Chinonen (DUQ und DDB) zeigten, dass ein aliphatischer Seitenrest am Chinon Einfluss auf die Art der Interaktion mit dem Enzym hat. Insgesamt wurden durch den kombinierten Einsatz mehrerer experimenteller und theoretischer Methoden neue Erkenntnisse über den Reaktionsmechanismus und seine vom Substrat abhängige Dynamik gewonnen, die nicht zuletzt zu Erklärung kontroverser Ergebnisse in der Literatur beitragen konnten. Ein drittes Modellsystem stellt der Lichtrezeptor Bakteriophytochrom dar, in dem die lichtinduzierte E/Z-Isomerisierung eines Tetrapyrrol-Kofaktors eine intramolekulare Reorientierung des Proteins auslöst und letztendlich zu einer Signalweiterleitung durch Histidin-Phosphorylierung führt. Dabei durchläuft der Kofaktor einen Photozyklus mit komplexen Veränderungen der Protein-Kofaktor-Wechselwirkungen. Durch die große Flexibilität des Tetrapyrrols spielen diese Wechselwirkungen bereits im thermisch stabilen Grundzustand eine große Rolle, die Ermittlung der tatsächlichen räumlichen Struktur des Kofaktors innerhalb der Proteinumgebung stellt eine Herausforderung dar. In dieser Arbeit wurde die Struktur des Kofaktors Biliverdin (BV) im Pfr Grundzustand des Bakteriophytochroms Pap1 charakterisiert und die theoretische Methode des QM/MM Hybridansatzes verwendet, um die Schwingungsspektren des Kofaktors zu berechnen. Zusätzlich wurde der Ansatz mit moleküldynamischen Simulationen kombiniert, um der konformationellen Flexibilität Rechnung zu tragen. Für verschiedene Zeitpunkte der Simulation wurden die optimierten Molekülstrukturen und die Ramanspektren berechnet. Die Summe dieser Spektren wies gegenüber den Einzelspektren eine deutlich höhere Übereinstimmung der Bandenposition und intensität mit den entsprechenden experimentell bestimmten Spektren auf. Da die Art der Proteinanbindung des BV und die genaue Konformation der vier Pyrrolringe anhand der Kristallstruktur nicht eindeutig bestimmt werden konnten, wurden diese Aspekte mit der QM/MM Methode untersucht und die Schwingungsspektren für unterschiedlich modifizierte Kofaktoren berechnet. Für den BV Kofaktor im Pfr Zustand wurden so eine ZZEssa Konfiguration und eine Anbindung des Kofaktors mittels einer BV-artigen Struktur (im Gegensatz zu einer PΦB-artigen Anbindung) bestimmt. Für den unmodifizierten BV Kofaktor ergab eine Korrelationsanalyse des erhaltenen Satzes von strukturellen und spektralen Daten eine Vielzahl signifikanter Zusammenhänge, die neue Einblicke ermöglichten. Dabei zeigten sich auch mehrere bereits bekannte Zusammenhänge struktureller und spektroskopischer Art, die so als Validierung des weiterentwickelten methodischen Ansatzes fungieren