Study of a bacterial polysaccharide biosynthesis : towards the recombinant production of heteropolysaccharide

The marine bacteria Vibrio diabolicus produces an exopolysaccharide (EPS) called HE800. The native form of HE800 has already shown biological efficiency in bone healing. It is studied as glycosaminoglycan-mimetic for applications in cosmetic and human health. To enhance biotechnological applications of polysaccharides, the chemical structures should be properly controlled; moreover, the production yield could also be a bottleneck. The genetic cluster of the HE800 EPS biosynthesis has been identified in 2014. However, the biosynthesis molecular mechanisms and regulations remain sometimes unclear. The main objective of this work is to obtain a recombinant production of the HE800 EPS in the common host Escherichia coli, to improve the knowledge of its biosynthesis mechanisms. During this thesis, a comparative study in Vibrionaceae genomes was conducted to identify EPS biosynthesis genetic clusters similar to the HE800 one; it reveals that this cluster is largely widespread and present in 70 % of the 103 genomes studied. The gene cluster responsible for the HE800 production has been cloned in Escherichia coli. Many tests were performed, but no recombinant production was obtained, showing the complexity of the biosynthesis mechanisms and regulation. These mechanisms were further investigated by transcriptomic analysis of V. diabolicus upon HE800 biosynthesis. In addition, qPCR transcriptional studies of V. diabolicus and of the recombinant strain have highlighted the SypG protein importance in the cluster expression regulation.La bactérie Vibrio diabolicus produit un exopolysaccharide (EPS) appelé HE800. Le HE800, sous sa forme native, a déjà montré des propriétés cicatrisantes comme implant de comblement osseux ; il est actuellement étudié pour des applications en cosmétique ou en santé humaine en tant que glycosaminoglycane-mimétique. Pour des applications biotechnologiques, les structures chimiques des polysaccharides doivent être contrôlées ; le rendement de production peut aussi être un verrou technologique. Cependant, les mécanismes moléculaires de la biosynthèse et les régulations ne sont pas toujours bien connus. Le cluster génétique de la biosynthèse de cet EPS a été décrit en 2014. L’objectif de ce présent travail était d’obtenir une production recombinante du HE800 dans Escherichia coli, afin d’approfondir la connaissance de ses mécanismes de biosynthèse. Lors de cette thèse, une étude comparative chez les Vibrionaceae, par bioinformatique, de clusters génétiques de biosynthèse d’EPS similaires à celui du HE800 a montré qu’il était largement distribué puisqu’il est présent chez 70% des 103 génomes étudiés. Le cluster de gènes responsable de la production du HE800 a été cloné chez Escherichia coli. De nombreux tests ont été réalisés mais aucune production recombinante n’a été obtenue montrant la complexité des mécanismes de la biosynthèse et de sa régulation. Ces mécanismes ont été examinés par analyse transcriptomique de la bactérie V. diabolicus au cours de la biosynthèse du HE800. De plus, des études transcriptionnelles par qPCR chez V. diabolicus et la souche recombinante ont, par ailleurs, permis de mettre en évidence le rôle de la protéine SypG dans la régulation du cluster