Produção, Caracterização e Purificação de Enzimas Proteolíticas Produzidas por Bacillus sp. em Sistema de Suas Fases Aquosas.

Proteases catalisam a quebra das ligações peptídicas em proteínas. Entre as aplicações farmacêuticas de proteases microbianas estão o tratamento da trombose, agentes quimioterápicos, pomadas cicatrizantes, entre outros. Uma variedade de enzimas microbianas têm sido amplamente estudadas e utilizadas como agentes trombolíticos. Nesta pesquisa serão analisadas Bacillus sp. produtores de protease isolado de solo Amazônico. Dos cultivos será retirado 1000 µmL para inoculação em Solução de Manachini, pH 7,0, adicionada de gelatina 1%. Para a determinação da atividade proteolítica, 150µL do extrato bruto com 1,5mL de caseína 2,0%(p/v), 1,0mL de Tampão Fosfato 0,15M, pH 7,5 e 0,5mL de solução enzimática foram incubadas a 30ºC/30min. A reação foi paralisada com 3,0mL de solução 0,4M de TCA, filtrada em papel Whatman 42. A absorbância do filtrado será determinada a 280nm. Será preparado um tubo branco para cada amostra. O pH ótimo será determinado em diferentes valores de pH utilizando soluções tampões e incubados por 1 hora. O tempo de incubação das amostras será de 0 a 90 minutos para cada faixa de pH, determinando-se atividade enzimática a cada 10 minutos. Para avaliar o efeito da temperatura na atividade proteolítica, o sistema de reação e o branco serão realizados em triplicata e incubados nas temperaturas de 25oC a 80 oC por 1 hora e determinada a atividade enzimática. Para os ensaios de estabilidade o extrato enzimático será incubado nas temperaturas de 25 ºC a 80 ºC e o tempo de incubação das amostras será de 0 a 90 minutos, determinando-se atividade enzimática a cada 10 minutos. A influência das variáveis será realizado com um ensaio fatorial (23) com 4 repetições do ponto central, os fatores serão a massa molar do PEG, o pH e as concentrações de citrato, as análises serão referentes a atividade enzimática, o fator de purificação, rendimento teórico, coeficiente de partição da enzima e a seletividade. Todas as análises serão realizadas com o programa Minitab 14.0. Os experimentos para extração das enzimas serão realizados com solução de Polietileno Glicol (50% p/v) de diferentes massas molares, PEG 400, 4000 e 6000 e soluções de fosfato (40%), consistindo de uma mistura de quantidades adequadas de KH2PO4 e K2HPO4, em pH 7,0; 8,0 e 9,0. O sistema será preparado em tubo de centrífuga graduado contendo uma mistura de quantidade necessária de polímero e sal, no qual será adicionado o extrato enzimático com as proteases que representará 20%(m/m), do total da massa do sistema, no qual será adicionado água para completar peso final de 3g. Os sistemas serão agitados em vortex por 60 segundos e as duas fases separadas por 60 minutos. Os volumes da fase superior e inferior serão medidas, separando-se com pipetas, cada uma dessas fases para determinação da atividade proteolítica e teor de proteína. Serão determinados ainda o coeficiente de partição protease, seletividade e rendimento teórico % e o fator de purificação (grau de pureza).FAPEA