Role of NLRP7 protein in normal and tumor pregnancies

Les môles hydatiformes complètes (MHC) sont des lésions bénignes précancéreuses du placenta qui dans 5% des cas évoluent vers un cancer très prolifératif dénommé, choriocarcinome (CC). Différents travaux ont rapporté une corrélation entre le développement des MHC récurrentes et les mutations du gène NLRP7. Ce gène code pour la protéine NLRP7 de l’inflammasome dont l’activation contribue à la production d’IL-1 et IL-18. La majorité des travaux publiés à ce jour se sont intéressés à l’étude des mutations de NLRP7. En revanche, aucune étude n’a caractérisé son rôle dans la placentation normale et tumorale. L’objectif de mon projet de thèse était de caractériser le rôle de cette protéine dans le placenta normal et tumoral. Trois approches ont été utilisées, i) Clinique, en collaboration avec le CHU de Casablanca ; le centre de référence Français des Maladies Gestationnelles Trophoblastiques (MGT) et l’Université Mc Gill pour l’accès aux tissus et sera collectés chez des patientes MHC ou CC; ii) In Vitro/Ex Vivo, pour la caractérisation du rôle du NLRP7 dans les processus clés du développement placentaire normal et tumoral dans des systèmes de cultures en 2D et 3D. Deux lignées trophoblastiques ont été utilisées, les cellules non tumorales HTR-8 Sv/Neo et la lignée JEG3 issue d’un CC humain ; iii) In Vivo, par l’injection orthotopique de cellules JEG3, invalidées ou non pour l’expression du gène NLRP7 (stratégie ShRNA), dans le placenta de souris gestantes. L’impact tumoral des JEG3 suite à leur injection dans la corne utérine et dans la veine de la queue de souris non gestantes a également été étudié.Mes travaux ont démontré que la protéine NLRP7 est abondamment exprimée dans le placenta normal au cours du premier trimestre de la grossesse, que son expression est régulée positivement par l’hypoxie, paramètre clé du développement du placenta et que cette protéine contrôle les processus clés du développement placentaire comme la prolifération et la différentiation trophoblastique. Par ailleurs, j’ai aussi démontré que NLRP7 joue un rôle compensatoire important dans la pathologie du retard de croissance intra-utérin. En relation avec le développement tumoral placentaire, mes travaux ont démontré que, i) la protéine NLRP7 est augmentée dans le placenta de patientes MHC et CC, et que les protéines de la machinerie des inflammasomes sont aussi dérégulées, ii) les cellules tumorales JEG3 surexpriment le NLRP7 comparé au HTR-8 Sv/Neo, iii) l’invalidation de NLRP7 dans les JEG3 induit une baisse de leur prolifération et augmentation de leur migration et invasion dans les systèmes de culture 2D et 3D. L’étude in vivo a démontré que l’invalidation de NLRP7 diminue le développement et la métastase du CC humain dans les trois modèles étudiés. Les analyses immunohistologiques, RNAseq et anticorps-array ont permis la caractérisation des mécanismes régulés par la protéine NLRP7 dans les JEG3. L’ensemble de mes travaux ont mis en évidence le rôle critique de la protéine NLRP7 dans le développement placentaire normal et tumoral et proposent la machinerie NLRP7 comme cible potentielle pour le traitement du CC.Complete hydatidiform moles (CHM) are benign precancerous lesions of the placenta that evolve in 5% of cases into a highly proliferative cancer called choriocarcinoma (CC). Numerous studies have reported correlations between the development of recurrent CHM and mutations in the NLRP7 gene. NLRP7 protein belongs the NLRP7-inflammasome, whose activation contributes to the production of mature IL-1 and IL-18. Most of the work published on NLRP7 was focused on the study of NLRP7 mutations in CHM. Though, no study has characterized its role in normal and tumor placental development. The aim of my thesis project was to characterize the role of this protein in the normal and tumor placenta. Three approaches were used, i) A clinical approach, in collaboration with Casablanca University Hospital; the French reference center of Trophoblastic Gestational Disease and with McGill University. These collaborations allowed for tissue access from MHC and CC patients; ii) An in Vitro / Ex Vivo approach for the characterization of the role of NLRP7 in key processes of normal and tumor placental development using 2D and 3D culture systems. Two trophoblastic cell types were used, a non-tumor cell line, the HTR-8 Sv/Neo and the JEG3 cells, derived from human CC; iii) An In Vivo approach through orthotopic injection of JEG3 cells, invalidated or not for the expression of the NLRP7 gene (ShRNA strategy), in the placenta of gravid mice. The tumor impact of JEG3 following their injection into the uterine horn and the vein of the tail of non-pregnant mice was also examined.The first part of my work showed that NLRP7 protein is abundantly expressed in the normal placenta during the first trimester of pregnancy, that its expression is upregulated by hypoxia, a key parameter in placental development, and that this protein controls key processes of placental development such as proliferation and differentiation. Importantly, I have also demonstrated that NLRP7 plays an important compensatory role in the pathology of intrauterine growth retardation. The second part of my work concerning the role of NLRP7 protein in the placental tumor development demonstrated that i) NLRP7 protein levels are increased in the placenta of MHC and CC patients, and that components of the inflammasome machinery are also deregulated, ii) the JEG3 cells overexpress NLRP7 compared to HTR-8 Sv/Neo, iii) NLRP7 knock-down in JEG3 induced a significant decrease in their proliferation and an increase in their migration and invasion both in the 2D and 3D culture systems. The in vivo study demonstrated that the knock-down of NLRP7 decreased the development and metastasis of human CC in the three tested routes. Immunohistological, RNAseq and antibody-array analyses allowed the characterization of the pathways regulated by the NLRP7 protein in JEG3 cells.Altogether my PhD project characterized the critical role of the NLRP7 protein in normal and tumor placental development and proposes the NLRP7 machinery as a potential target for CC treatment