Energy and conformational landscape of Synaptotagmin-1 interacting with membranes

A l’arrivée d’un potentiel d’action au niveau d’une synapse neuronale, des ions calcium (Ca2+) pénètrent dans le neurone, permettant aux protéines SNAREs (N-ethylmaleimide-sensitive factor activating protein receptor) de s’assembler entièrement, engendrant la fusion des vésicules synaptiques contenant les neurotransmetteurs avec la membrane plasmique du neurone. Des protéines régulatrices telles que la Complexine et la Synaptotagmine sont étroitement couplées aux SNAREs et permettent une fusion rapide et synchrone. La Synaptotagmin-1 (Syt1), une protéine transmembranaire localisée sur les vésicules synaptiques, est le senseur calcique de la neurotransmission. Syt1 possède deux domaines de liaison au Ca2+, C2A et C2B, un domaine flexible reliant la région membranaire au C2A, ainsi qu’un court lien entre C2A et C2B. Il a été montré qu’une région polybasique dans le C2B se liait aux lipides anioniques tels que phosphatidylserine (PS) et phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) en l’absence de Ca2+. A l’entrée du Ca2+, les ions Ca2+ se lient au C2A et au C2B. La liaison de Syt1 aux ions Ca2+ permet aux résidus non polaires à proximité des sites de liaison au Ca2+ de s’insérer dans la membrane. Si ces mécanismes sont relativement bien acceptés, les mécanismes biochimiques et biophysiques précis du déclenchement de la fusion induit par la liaison de Syt1 au Ca2+ restent flous. Dans ce travail, nous mesurons directement les interactions de Syt1 liée à une membrane avec des membranes anioniques comprenant des lipides PS et PIP2 par un appareil à force de surface (SFA), afin d’imiter la membrane d’une vésicule synaptique contenant Syt1 interagissant avec la membrane plasmique anionique. Nous réalisons une mutagénèse dirigée sur les sites de liaison au Ca2+ de C2A et C2B, ainsi que sur le site polybasique de C2B, pour entièrement cartographier les énergies de liaison à la membrane relatives à ces sites, à la fois en présence et en l’absence d’ions divalents. Nous trouvons que Syt1 se lie avec une énergie de ~6 kBT dans l’EGTA, ~10 kBT dans le Mg2+, et ~18 kBT dans le Ca2+. Des réarrangements moléculaires mesurés pendant le confinement de Syt1 entre les membranes prévalent dans le Ca2+ et dans le Mg2+, et suggèrent que Syt1 se lie initialement via le C2B puis réoriente ses domaines C2 dans la conformation de liaison privilégiée. La neutralisation des sites de liaison au Ca2+ de C2B engendre une réduction radicale de l’énergie de liaison de Syt1 dans le Ca2+, alors que la même mutation dans le C2A a un effet plus nuancé. Ces résultats éclairent sur la coopérativité de C2A et C2B dans leur liaison à la membrane, et montrent un rôle apparent prédominant de C2B.Upon arrival of an action potential at the neuronal synapse, calcium ions (Ca2+) enter the neuron, allowing soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor activating protein receptor (SNARE) proteins to fully zipper, leading to the fusion of pre-docked synaptic vesicles containing neurotransmitters with the plasma membrane of the neurone. Regulatory proteins such as Complexin and Synaptotagmin are closely coupled to SNAREs during synaptic vesicle fusion and lead to synchronous, fast fusion. Synaptotagmin-1 (Syt1) is a transmembrane protein found in synaptic vesicles and is the Ca2+ sensor for synaptic transmission. Syt1 has two Ca2+ binding domains, C2A and C2B, with a flexible linker domain from the membrane region to C2A, and a short linker between C2A and C2B. A polybasic patch in C2B has been shown to bind to anionic lipids such as phophidylserine (PS) and phosphisotinol (PIP2) in the absence of Ca2+. Upon Ca2+ influx, Ca2+ ions bind in C2A and C2B. Ca2+ binding to Syt1 allows non-polar residues nearby the Ca2+ binding sites to insert into the membrane. While these mechanisms are relatively well-accepted, the precise biochemical and biophysical mechanisms for the Syt1 Ca2+ trigger remain unclear. In this work, we directly measure the interactions of Syt1-coated membranes with anionic membranes including PS and PIP2 lipids by the surface forces apparatus (SFA) technique, in order to mimic a Syt1-coated synaptic vesicle membrane interacting with the anionic plasma membrane. We perform site directed mutagenesis of the Ca2+ binding sites of C2A and C2B, along with the polybasic patch in C2B, to fully map the site-binding energetics of Syt1 with membranes, both in the absence and presence of divalent ions. We find that Syt1 binds with ~6 kBT in EGTA, ~10 kBT in Mg2+, and ~18 kBT in Ca2+. Molecular rearrangements measured during confinement of Syt1 between membranes are more prevalent in Ca2+ and Mg2+ and suggest that Syt1 initially binds through C2B, then reorients the C2 domains into the preferred binding configuration. Neutralization of C2B Ca2+ binding site leads to a drastic decrease of Syt1 binding energy in Ca2+, while the same mutation in C2A has a milder effect. These results illuminate that C2A and C2B cooperate in membrane binding, with an apparent predominant role of C2B