Role of the PB1 protein in the influenza virus polymerase complex fidelity

Les virus influenza de type A (IAV) appartiennent à la famille des Orthomyxoviridae. Ces virus enveloppés présentent un génome composé de 8 segments d’ARN simple brin, de polarité négative. Chaque segment est encapsidé par les nucléoprotéines (NP) et associé au complexe polymérase viral, hétérotrimère composé des sous-unités PB1, PB2 et PA, pour former la ribonucléoprotéine virale (RNPv). La protéine PB1 est la sous-unité catalytique responsable de l’activité ARN polymérase ARN-dépendante du complexe viral. La RNPv représente ainsi l’unité minimale de transcription et réplication du génome viral. En raison de la faible fidélité de la polymérase virale et l’absence d’activité de relecture, les IAV présentent un taux de mutation élevé, responsable du développement rapide de populations virales d’une grande diversité génétique, appelées quasi-espèces. Des études récentes ont permis d’identifier des mutants présentant une fidélité de réplication augmentée, due à des mutations uniques dans la sous-unité PB1. Comme décrit pour d’autres virus à ARN, différentes mutations peuvent avoir un effet similaire sur l’activité de la polymérase virale. Afin d’approfondir la caractérisation de la protéine PB1 nous avons recherché d’autres positions pouvant avoir un rôle dans la fidélité de la polymérase, la sélectivité des nucléotides ou la processivité du complexe. Pour cela, des banques de séquences PB1 mutées ont été générées par mutagénèse aléatoire pour deux sous-types de virus influenza A, H3N2 et H1N1pdm09, circulant actuellement chez l’homme. A partir de ces banques, des expériences de reconstitution transitoire de RNPv fonctionnelles (minigénome) en présence de ribavirine, un analogue nucléosidique mutagène, ont permis d’évaluer l’activité de la polymérase et de sélectionner, après subdivisions successives des banques, des mutations conférant une résistance au composé mutagène supérieure à celle de la polymérase sauvage. Les mutations ainsi identifiées dans différentes régions du segment PB1 ont ensuite été réintroduites de manière spécifique, par mutagénèse dirigée, dans la séquence du gène PB1. L’impact de ces mutations sur l’activité de la polymérase a été évalué par des expériences de minigénome en présence et absence de ribavirine. Les mutations pour lesquelles la résistance à la ribavirine a été confirmée ont alors été introduites par génétique inverse dans le contexte du génome viral complet. La majorité des mutations s’est avérée viable et a permis l’obtention de virus mutants infectieux. La capacité de multiplication des virus mutants a été évaluée en cellules MDCK et comparée à celle des virus sauvages correspondants, en absence et en présence de ribavirine. Ainsi, deux mutants porteurs de deux mutations différentes, localisées dans des régions distinctes de la protéine PB1, présentent une capacité à résister à la ribavirine supérieure à celle du virus sauvage. L’analyse de la diversité des populations virales, évaluée par séquençage à haut-débit, en utilisant la technologie Illumina, permettra de confirmer si cette résistance à la ribavirine est bien liée à une augmentation de la fidélité de la polymérase virale. Cette étude a ainsi permis de préciser les éléments de la protéine PB1 impliqués dans l’activité et potentiellement la fidélité de la réplication virale pour deux sous-types de virus influenza AInfluenza type A viruses (IAVs) belong to the Orthomyxoviridae family. The genome of these enveloped viruses consists of 8 single-stranded RNA segments of negative polarity. Each segment is encapsidated by oligomers of the nucleoprotein (NP) and associated with the viral polymerase complex, a heterotrimer composed of the PB1, PB2 and PA subunits to form the viral ribonucleoproteins (vRNPs). The PB1 protein is the catalytic subunit of the polymerase complex, harboring the RNA-dependent RNA polymerase activity. The vRNP represents the minimal functional unit for transcription and replication of the viral genome. Given the low fidelity and lack of proofreading activity of their polymerase, IAVs have a high mutation rate leading to the rapid development of viral populations with high genetic diversity, called quasispecies. Recent studies identified mutants with increased replication fidelity, due to single mutations in the PB1 subunit. As described with other RNA viruses, different mutations could have similar effects on the activity of the viral polymerase. To improve the characterization of the PB1 protein, we searched for other positions that may have a role on polymerase fidelity, nucleotide selectivity or complex processivity. For this purpose, random mutagenesis was used to generate libraries of mutated PB1 from influenza A virus subtypes H3N2 and H1N1pdm09, currently circulating in humans. From these libraries, transient reconstitution of functional vRNPs (minigenome) experiments were performed with ribavirin, a mutagenic nucleoside analog, to evaluate the polymerase activity. Upon selection based on the polymerase activity of successively subdivided libraries, PB1 mutations with increased polymerase activity in the presence of ribavirin relative to wild-type were identified in several regions of PB1. These mutations were specifically re-introduced in PB1 by directed mutagenesis. Their impact on polymerase activity was evaluated by minigenome experiments with and without ribavirin. Mutations with confirmed resistance against ribavirin were then introduced in the context of infectious virus by reverse genetics. Most corresponding mutant viruses could be rescued. Their growth characteristics were analysed in MDCK cells and compared to the corresponding wild-type viruses, in the presence or absence of ribavirin. Two mutants carrying two different mutations, located in distinct regions of the PB1 protein, displayed an improved capacity to resist ribavirin relative to the wild-type virus. Viral populations genetic diversity analysis by next-generation sequencing, using Illumina technology, will confirm whether the observed resistance against ribavirin is linked to an increase of the viral polymerase fidelity. This study provides insights into the PB1 domains involved in the activity and potentially the viral replication fidelity of two influenza A virus subtype