Identification and characterization of the chloride channel, AtCLCg, involved in salt stress response in Arabidopsis thaliana

Dans les cellules végétales, les canaux et les transporteurs anioniques sont essentiels pour les fonctions clés telles que la nutrition, l'homéostasie ionique et la tolérance aux stress biotiques ou abiotiques. Chez Arabidopsis thaliana, les membres de la famille CLC (pour ChLoride Channel), situés sur le tonoplaste, sont requis pour l'homéostasie du nitrate (AtCLCa et AtCLCb) ou impliqués dans la tolérance au sel (AtCLCc).Dans mon travail de thèse, j’ai identifié et caractérisé un canal chlorure, AtCLCg, chez A. thaliana. L'étude de la protéine fusion AtCLCg::GFP a révélé que cette protéine est localisée sur le tonoplaste. Deux lignés mutants indépendants d’insertion ADN-T, atclcg ont été sélectionnés. Les études physiologiques sur ces deux lignés ont démontré qu’AtCLCg joue un rôle dans le passage de chlorure mais pas dans l'homéostasie du nitrate au travers du tonoplaste. En effet, aucune différence de contenu en nitrate (NO3-) racinaire et foliaire n’a été observée entre le sauvage et les mutants dans nos conditions. Par contre, les plantes mutantes présentent un phénotype par rapport au sauvage lorsqu'elles se développent sur milieu de croissance contenant 75 mM NaCl: (i) une diminution de 20% de la masse fraîche ; (ii) une diminution de 16% de la longueur de racines primaires et une réduction de 19% du nombre de racines secondaires ; (iii) une sur-accumulation de 21% et 26% de chlorure et sulfate foliaire, respectivement. Ces phénotypes sont abolis chez les lignés complétées avec 35S::AtCLCg. De plus, les mutants atclcg présentent un phénotype similaire à la présence de 75 mM KCl, mais aucune différence n'est détectée en réponse à 140 mM mannitol. Ce résultat suggère que le phénotype d'hypersensibilité des mutants atclcg dépend du chlorure et non du l'effet osmotique du stress salin.Sachant qu’AtCLCg et AtCLCc partagent un haut degré d'homologie, environ 75% d'identité au niveau des protéines, et que les deux sont impliquées dans la réponse au stress salin de la plante, nous avons généré le double mutant atclcc/atclcg. L’analyse phénotypique a montré que le double mutant ne présente pas un phénotype additif sur milieu de stress 75 mM NaCl. En parallèle, l'analyse de l'expression des gènes a montré qu’AtCLCg est réprimé dans le fond mutant atclcc, et inversement. Par ailleurs, l'analyse de l'expression de gène rapporteur démontre que PAtCLCg::GUS est fortement exprimé dans les cellules du mésophylle alors qu’une forte expression de PAtCLCc::GUS dans les cellules de garde et le pollen est observé. Ainsi, l’ensemble de ces résultats montrent que ces deux protéines AtCLCc et AtCLCg sont impliquées dans la réponse au stress salin de la plante, mais elles n’ont pas de fonction redondante.In plant cells, anion channels and transporters are essential for key functions such as nutrition, ion homeostasis and, resistance to biotic or abiotic stresses. In Arabidopsis thaliana, members of the ChLoride Channel (CLC) family located on the tonoplast have been shown to be required for nitrate homeostasis (AtCLCa, AtCLCb) or involved in salt tolerance (AtCLCc). In this study, we identified and characterized the chloride channel AtCLCg in A. thaliana. Use of an AtCLCg:GFP fusion revealed the localization of this protein on the tonoplast. Studies on the disruption of the AtCLCg gene by a T-DNA insertion in two independent lines demonstrated that AtCLCg is involved in response to salt stress and not in nitrate homeostasis in our conditions. Although no difference in shoot and root NO3- content is observed, mutant plants show a phenotype compared to wild-type when they are grown on 75 mM NaCl: (i) a decrease by 20% of total plant fresh weight; (ii) a diminution by 16% of primary root length and a reduction by 19% of secondary root number; (iii) an over-accumulation of chloride and sulfate in shoots by 21% and 26% respectively. These phenotypes are abolished in complemented lines with 35S::AtCLCg. atclcg mutants show a similar phenotype in the presence of 75 mM KCl, but no difference is detected in response to 140 mM mannitol. This result suggests that the hypersensitivity phenotype of atclcg mutant depends on the ionic component and not on osmotic effect of salt stress.Knowing that AtCLCg and AtCLCc share a high degree of homology, approximately 75% of identity at protein level, and both are involved in response to salt stress, we generated a clcc/clcg double mutant. Phenotypic analysis showed that the two KO mutations do not have additive effect under salt stress of 75 mM NaCl. In parallel, gene expression analysis showed that AtCLCg is repressed in the clcc mutant background, and conversely. Expression analysis of reporter gene displayed a different pattern for PAtCLCg::GUS, strongly expressed in mesophyll cells, compared with a strong expression of PAtCLCc::GUS in guard cells and pollen. Altogether these results demonstrate that both AtCLCc and AtCLCg are involved in response to salt stress but they are not functionally redundant