Unveiling Ubiquitination as a New Regulatory Mechanism of the ESCRT-III Protein CHMP1B

J’ai effectué ma thèse dans le groupe du Dr. Marie-Odile Fauvarque qui met en œuvre des stratégies de génétique moléculaire sur des modèles de cellules humaines et chez la mouche drosophile pour l'étude de la fonction des protéines dans la signalisation intracellulaire. Dans ce contexte, mes travaux visaient à produire des connaissances fondamentales sur le système ubiquitine dans le contrôle du trafic endocytaire, en particulier de récepteurs membranaires impliqués dans la réponse inflammatoire (TNFR, ILR) ou la différenciation et la croissance cellulaire (EGFR). Je me suis notamment intéressée au rôle du complexe formé par l’interaction entre une protéine de la voie endocytaire, CHMP1B, et la protéase d’ubiquitine UBPY (synonyme USP8). CHMP1B est un membre de la famille ESCRT-III qui, via des processus de changements de conformation et de polymérisation à la membrane, contrôle la biogenèse des vésicules intraluménales (ILVs) au niveau des endosomes tardifs pour former les corps multivésiculaires (MVBs). Ces derniers fusionnent avec les lysosomes, assurant ainsi la protéolyse des récepteurs internalisés et l‘arrêt de la signalisation intracellulaire. Alternativement, les récepteurs peuvent être renvoyés à la membrane plasmique à partir des endosomes précoces ou tardifs via des vésicules de recyclage. Le trafic intracellulaire et le tri des récepteurs dans ces différents compartiments subcellulaires jouent un rôle majeur dans l’activation, la durée et la terminaison des signaux intracellulaires. Or, la liaison covalente d’une ou plusieurs ubiquitine (un polypeptide très conservé de 76 aminoacides) au niveau des récepteurs est un signal majeur déclenchant leur internalisation. En hydrolysant cette ubiquitine, UBPY peut stopper l’internalisation des récepteurs au niveau de la membrane plasmique, ou bien, favoriser leur entrée dans le MVB. UBPY jouerait ainsi deux rôles opposés sur la stabilité des récepteurs selon son niveau d’action dans la cellule. L’interaction entre CHMP1B et UBPY avait été décrite dans la littérature chez la levure ou par co-immunoprécipitation à partir de lysat cellulaires. Cependant, les travaux de l’équipe montraient l’absence d’interaction forte entre les domaines d’interaction de ces deux protéines in vitro et par ailleurs, la fonction de cette interaction dans le processus d’endocytose n’avait été que partiellement élucidée. J’ai confirmé l’existence du complexe CHMP1B-UBPY in cellulo qui se localise essentiellement au niveau des endosomes tardifs. J’ai déterminé la région impliquée dans cette interaction et prouvé que l’existence de ce complexe permet de stabiliser les deux protéines dans les cellules. J’ai ensuite démontré l’existence de formes ubiquitinées monomériques et dimériques de CHMP1B dans lesquelles la liaison d’une molécule d’ubiquitine sur une des deux lysines d’une boucle flexible de la protéine induit un probable changement de conformation. De plus, UBPY hydrolyse cette ubiquitine et favorise l’accumulation d’oligomères de CHMP1B qui sont dépourvues d’ubiquitine. Finalement, le traitement des cellules par l’EGF, qui se lie à l’EGFR et provoque son internalisation, induit le recrutement transitoire des dimères ubiquitinés de CHMP1B aux membranes. L’analyse du trafic intracellulaire de l’EGFR et de la morphogenèse de l’aile de drosophile dans différents contextes génétiques a également prouvé que la forme ubiquitinée de CHMP1B est essentielle à sa fonction. L’ensemble de mes travaux m’autorisent à formuler une hypothèse complètement nouvelle dans laquelle l’ubiquitination de CHMP1B induit une conformation ouverte de la protéine incapable de polymériser qui est recrutée sous forme de dimères à la membrane des endosomes où la présence d’UBPY induit la deubiquitination et la polymérisation concomitante de CHMP1B, très probablement en hétéro-complexes avec d’autres membres de la famille ESCRT-III agissant de concert pour la déformation et la scission des membranes.I did my thesis in the group of Dr. Marie-Odile Fauvarque who implements strategies of molecular genetics on human cell culture models and in the Drosophila fly for the identification and study of the function of proteins in intracellular signaling. In this context, my work aimed to produce fundamental knowledge about the ubiquitin system in the control of the endocytic trafficking, in particular of membrane receptors involved in the inflammatory response (TNFR, ILR) or cell differentiation and growth (EGFR). I was particularly interested in the role of the complex formed by the interaction between an endocytic protein, CHMP1B, and the ubiquitin protease UBPY (synonym USP8). CHMP1B is a member of the ESCRT-III family that controls the biogenesis of intraluminal vesicles (ILVs) at the late endosomes to form multivesicular bodies (MVBs) Conformational change and polymerization at lipidic membrane processes are needed for CHMP1B function. MVBs fuse with the lysosomes, thus ensuring the proteolysis of the internalized receptors and the stoppage of the intracellular signaling. Alternatively, the receptors may be returned to the plasma membrane from early or late endosomes via recycling vesicles. Intracellular trafficking and receptor sorting in these different subcellular compartments play a major role in the activation, duration and termination of intracellular signals. The covalent bond of one or more ubiquitin (a highly conserved polypeptide of 76 amino acids) at the receptors is a major signal triggering their internalization. By hydrolyzing this ubiquitin, UBPY can stop the internalization of receptors at the plasma membrane, or promote their entry into the MVB. UBPY would thus play two opposing roles on the stability of the receptors depending on its level of action in the cell. The interaction between the two proteins CHMP1B and UBPY had been described in the literature in the two-hybrid system in yeast or by co-immunoprecipitation from cell lysates. However, the team's work showed no strong interaction between the domains of interaction of these two proteins in vitro and the function of this interaction in the endocytosis process had only been partially elucidated.During my thesis, I confirmed the existence of the CHMP1B-UBPY in cellulo complex, which is located mainly at the level of late endosomes. I determined the region involved in this interaction and proved that the existence of this complex makes possible the stabilization of both proteins into the cells. I then demonstrated the existence of monomeric and dimeric ubiquitinated forms of CHMP1B in which the binding of a molecule of ubiquitin to one of the two lysines of a flexible loop of the protein likely induces and/or stabilize a conformational conformation. In addition, UBPY hydrolyses this ubiquitin and promotes the accumulation of CHMP1B oligomers which are devoid of ubiquitin. Finally, the treatment of cells by EGF, which binds to EGFR and causes its internalization, induces transient recruitment of ubiquitinated CHMP1B dimers to the membranes. Analysis of the intracellular trafficking of EGFR and the morphogenesis of Drosophila wing in different genetic contexts has also shown that the ubiquitination of CHMP1B is essential to its function. My work has allowed me to formulate a completely new hypothesis in which the ubiquitination of CHMP1B induces an open conformation of the protein incapable of polymerizing in this state which is recruited in the form of dimers to the membrane of the endosomes and there the presence of UBPY induces the deubiquitination and the concomitant polymerization of CHMP1B, most probably in hetero-complexes with other members of the ESCRT-III family acting in concert for deformation and scission of the membranes